הפרומוטר promoter

יש אזורים שמבקרים שעתוק: enhancer, Proximal promotor region.

  we have activation domain for transcription factor.

יש פקטורי שעתוק ספיציפיים בנוסף ל- General transcription factor (שקשורים יותר ללפני שעתוק),

קו אקטבטור לא קושר דנ"א והוא כן משפיע על השעתוק ופקטורי השעתוק הם אלה שיביאו אותם לפרומוטור.

פקטור שעתוק קושר דנ"א ואז קו אקטבטור מגיע.

Transcription activator\transcription repressor=פקטור שעתוק.

פקטור שעתוק יכול להיות גם אקטיבטור וגם רפרסור.

Inner sequence הוא זה שקובע את התחלת השעתוק.

יכול להיות enhancer אחד שמשפיע על מספר גנים .

TSS=transcription start site.

TBP מכופף ומשטח את הדנ"א לכן הוא מעדיף את קשרי A-T.

The BRE is an upstream extension of a subset of TATA boxes. The DPE requires an Inr, and is located precisely at +28 to +32 relative to the A+1 nucleotide in the Inr. The DPE consensus was determined with Drosophila transcription factors and core promoters. The Inr consensus  sequence is shown for bothDrosophila (Dm) and humans (Hs).

לשעתוק יותר מדויק אנו נשים TATA BOX אשר הם יהיו יותר מבוקרים אבל פרומוטורים שהם לא TATA BOX הם יהיו פחות מבוקרים .

50% מהפרומוטורים הם CPG Ilence (חזרות של GC ) ולכן הן יהיו לא TATA BOX.=ומה שקורה כתוצאה ממצב זב הוא שבאותו אזור יש הרבה התחלות של שעתוק.

יש מוטציות ב- TATA BOXולכן הן יכולות לגרום להרבה מחלות כמו בטא טלסמיה-בבטא גלובין המוטציה ולחולה יהיה אנמיה ,ולכן הם הטרוזיגותי-והחולה יהיה אסימפטמתי.

בטא גלובין מיוצר אחרי חוד מהלידה לכן המחלה מופיעה רק חודש אחרי הלידה.

The MDM2 Promoter Contains a Single Nucleotide Polymorphism Which Alters the Affinity of the Transcriptional Activator.

 

 

BRE-נמצא לפני ואחרי ה-TATA BOX והוא קושר משני הצדדים כי ה-TFIIB  נמצא כאן והוא מכופף אותו ולכן יש קשירה .

DPE-למקם את השעתוק והוא לא משתנה ,תמיד הוא +28to+32.

Proximal control elements

 

                        CAAT BOX                                                        GC BOX

 

Sp1  קושר את אזור ה- CG.

יש מוטציות ב- core promotor +proximal promotor שגורמות למחלות.

AD=activation domain.                                     DBD=DNA binding domain.

Pre initiation complex  עובר אינטרקציה ומביא mediator+co activator.

Transcription activator  יש 2 domains : DBD+TAD בכדי לקבל שעתוק מלא ,אשר כל אחד לבד לא יכול להפעיל שעתוק.

איך מכמתים?

מכניסים פלסמיד לתא עם reporter gene שהוא luciferase שכאשר מוסיפים לו סובסטרט ,יש פירוק של הסובסטרט וכתוצאה מהפירוק נפלט אור .

Activator אחד לא מספיק.

Gal4=transcription activator gene  שהוא קושר רצף מאוד ספיציפי.

איך יודעים איזה פקטור יושב בפרומוטור?

1.גישה ביואינפורמטית.

2.שיטות ביוכימיות: two hybrid ;one hybrid ;three hybrid.

  ;one hybridיש לנו את ה- 30 נוקלאוטידים שחשובים לנו (כדאי כמה עותקים לפעילות) ,ספריית CDNA שמחובר ל-AD  (והחלבון הוא פקטור שעתוק שמבוטא )שכאשר מחברים את ה- luciferase+AD יש ביטוי .והביקורת שלנו תהיה בלי ספריית ה-CDNA.

two hybrid : משתמשים בחלבון בכדי לבדוק איזה חלבונים עוברים אינטרקציה איתו.לכן צריך: ספריית CDNA, reporter gene,חלבון.(יצרנו T.A כאשר יש אינטרקציה בין החלבון ל-CDNA).

חלבוני T.A אי אפשר לעשות איתם two hybrid.

Three hybrid :בכדי לדעת איזה מודיפקציות קורות אשר יש לי שני חלבונים ואז מכניסים CDNA ובודקים איזה מודיפקציות קורות.

 

^{Core promoters not only direct the initiation of transcription, but also participate in the specificity of enhancer function.}

^{footprinting:נסמן צד של דנ"א בסמן רדיואקטיבי ,ואז לשים דנאז והדנאז יתחיל לחתוך לי באופן אקראי ואיפה שיושב לי חלבון על הדנ"א הדנאז לא יכול לחתוך ולכן מריצים בגיל sequencing gel  ורואים אזור שאין בו בנדים וזה האזור שבו קושר החלבון.}

^{in vivo footprinting:מוסיפים חומר מסויים(DMS) שהוא נכנס לתאים ומסמן אותם,מפיקים דנ"א מהתאים ,מוסיפים להם primer  מסומן ומסתכלים.}

 

^{איך אפשר לדת שפקטור שעתוק 1 כן קושר את הרצף:}

^{1.להזמין אוליגו שמסומן בביוטין ונקח חלבון שמעניין אותנו ונשים אותם ביחד ואז נבוא עם סטיק של-bids של אבידין  ואז לעשות western blot  או mass spect.}

^{2.נשים נוגדן כנגד החלבון +חלבון+probe שמסומן בסמן רדיואקטיבי.}

^{השלב הבא הוא printshift: צריך  native gel : צריך קונטרול שזה הprobe לבד.}

^{השיטה- שמים את החלבון עם ה- probe מסומן במבחנה ואז מריצים בגיל וגם מריצים את הקונטרול ואז בגיל אנו מקבלים שני בנדים אחד שהוא של הקונטרול שרץ הכי למטה והשני של החלבון עם ה probe שהוא רץ יותר למעלה.}

^{לבדיקת ספיציפיות לקישור אפשר לעשות תחרות על ידי probe אחר מוטנטי ואז בהרצה בגיל אנו לא רואים מה נקשר כי הוא לא מסומן .}

^{עוד דבר שאפשר לעשות זה super shift וזה אומר להוסיף נוגדן ספיציפי  והוא ירוץ עוד יותר לאט.}