הבהרה משיעור קודם: sfp2 מהמסלול של Fgf (טירוזין קינאז) הוא לא GAP, הוא פוספאטאז, הוא יודע להוריד פוספטים שיושבים על חלבונים, הרצפטור עצמו כאשר הוא עובר פוספורילציה בנקודות מסוימות האתרים האלה הם recruiting של GAP, אם מורידים את הפוספטים האלה אנו לא מעשה recruiting ל- GAP . וזה מעין משוב חיובי, הגברה על ידי כך שאנו שמים את sfp2 שמוריד את הפוספטים ובעצם לא נותן ל- GAP בעצם להתחבר לממברנה.
Cleavage:
בביולוגיה ההתפתחותית יש לנו שלוש פאזות כאשר הראשונה היא cleavage והיום נתחיל איתה. זו פאזה שמגיעה מיד אחרי ההפריה. מהתרשים רואים
זרימה מה- primary oocyte משם מגיעים ל- maturation בתהליך זה בעצם ישנה חלוקה שבה מקבלים polar body(first) ו- oocyte. ה- polar body לוקח קצת מהמטען הגנטי,כי זו הייתה חלוקה.
האאוציט מתחיל לעבור תהליך של עוד חלוקה ואז הוא נעצר בשלב של המטאפאזה ובשלב הזה האאוציט בעצם מחכה להפריה ועד שלא תתרחש
הפריה יש שלב שנראה meiosis 2 arrest זה הסיטואציה הקפואה שיכולה גם לקחת שנים. השלב
הבא הוא שלב ה- fertilization, שלב ההפריה. ברגע שתא
הזרע מפרה את האאוציט זה בעצם הכתבה לצאת מה- arrest לסיים את החלוקה. ברגע
שתא הזרע נוגע באאוציט ומכניס את הגרעין שלו אנו רואים מיד שני גרעינים כי יש
חלוקה ומקבלים עוד polar body (second) ומקבלים שני גרעינים זכרי
ונקבי, עדיין אין איחוי בניהם. אחר כך מתרחש איחוי בין שני הגרעינים ומקבלים N4 כרומוזומים, מרגע זה החלוקות שמתרחשות הן אך ורק מיטוטיות, החלוקות
האלה יוצרות תחילה שני תאים וכך הלאה עד שמתקבל הבלסטוציט. זה התהליך באופן כללי.
אנחנו לא נתעסק בכל השלבים נתעסק רק משלב ההפריה.
מתחילים מהזיגוטה- fertilized Egg, הביצית המופרית מוקפת במעטפת שנקראת zona Pellucida , זו מעטפת שאיננה גמישה ( ניתן להשוות את זה לקליפה של ביצה) אי אפשר להתרחב במעטפת הזו , היא לא גמישה. המעטפת מורכבת מהרבה סוכרים וחלבונים. ברגע שמתחילה החלוקה הראשונה ומקבלים שני תאים אנו מתחילים את לה ה- cleavage, תאי הבת שנוצרים מתהליך החלוקה נקראים בלסטומרים Blastomeres . ממצב של שני תאים, של תא מתחלק ואנחנו מקבלים 4 תאים, הם יתנו 8 תאים, השלב הבא יהיה 16 תאים. לשלב של ה- 8 תאים קוראיםphase 8-cell אבל ברגע שהגענו ל-16 תאים אנו קוראים לשלב הזה מורולה Morula זה בעצם כדור של תאים שכולם בלסטומרים. במעבר מ-8 תאים ל-16 תאים קורה תהליך מסויים שנקרא First cell fate decision , יש שינויים דרמטים במעבר הזה ( אחד השינויים הכי דרמטיים בתהליכים ההתפתחותיים) אחרי שלב המורולה מגיע שלב ה- early blastocyte ברגע שמתחיל תהליך של יצירת חלל במורולה Cavitation זה בעצם השלב שאנחנו מגדירים את זה כבלסטוציט.
נשים לב שבינתיים כל החלוקות
מתרחשות במעטפת ה- zona Pellucida ולכן התאים קטנים בנפחם
כי המעטפת מגדירה חלל מאוד מוגדר וברור. אחרי ה- early
blastocyte , ברגע שרואים היווצרות של חלל קטן וכאשר רואים חלל גדול השלב
נקרא כבר בלסטוציט Blastocyst . אנחנו מבחינים בין early/mid/late blastocyte.
הבלסטוציט מורכב בעצם משני סוגי תאים שפונדמנטאלית שונים אחד מהשני, המעטפת מסביב נקראת Trophoectoderm והיא מורכבת מ- Trophoblast cells , שכבה חיצונית שהיא מסתכלת על zona Pellucida, התאים הפנימיים יותר נקראים Inner Cell Mass (ICM) cells . שני סוגי התאים הללו שונים אחד מהשני מאוד!! משלב זה יש כניסה ל- Irreversible step , ברגע שיש הבחנה בין שני הסוגים השונים אי אפשר לחזור אחורה בתהליך ההתפתחותי. הבלסטוציט רוצה להמשיך להתפתח אבל בתוך מעטפת ה- zona Pellucida הוא לא יכול להמשיך ולכן ישנו שלב (שמזכיר ציפורים) של hatching, זהו תהליך אקטיבי שבו הבלסטוציט הורס את ה - zona Pellucida ויוצא החוצה כדי שיהיה אפשר להמשיך בתהליך ההתפתחותי. ה- Inner Cell Mass (ICM) cells הולכים לתת את הfetus/embryo- העובר מתפתח מה- ICM. ה- Trophoectoderm לא נותן עובר !!!! הוא ייתן את רקמות החוץ עובריות, לדוגמא שלייה. שני סוגי התאים נותנים שני דברים שונים לגמרי.
רואים בתמונה את הזיגוטה, רואים את שני הגרעינים הזכרי והנקבי שעוברים
איחוי, זה מיד אחרי ההפריה. רואים גם את ה-
zona Pellucida מסביב ורואים גם את ה- polar body, רואים את כל המרכיבים מיד אחרי ההפריה.
ניתן לראות את שלב שמונת התאים, התאים הולכים וקטנים במרחב שלהם, כל תא הוא כדור
בפני עצמו. שלב אחר כך (מספר שעות אחרי)
זה אותו עובר אותם שמונה תאים אבל הוא עבר תהליך שנקרא compaction למעשה כל התאים שכל אחד
היה בפני עצמו, יש מצב של יצירת adhesions, הממברנות צמודות אחת לשנייה, הכל מאוד
קומפקטי ומאוד צמוד. לתהליך יש משמעות וחשיבות בתהליך ההתפתחותי. ממצב של שמונה
תאים עוהרים למצב של 16 תאים (מורולה) מהמורולה עוברים לבלסטוציט רואים את התאים
השונים ואז עוברים את תהליך ה- hatching (פעולה אקטיבית לא יודעים
על זה הרבה)
קצת מושגים..
Totipotent- תא שמסוגל ליצור כל תא שרוצים
עוברי או חוץ עוברי, יש לו את הפוטנציאל להיות כל תא!
Oligopotent– הפוטנציאל הולך ויורד,
יכול לתת כמה סוגים של תאים בגוף ולא כל תא בגוף!
Unipotent – תא מסויים שיכול לתת lineage אחד מוגדר.
ובסוף אנחנו מקבלים דיפרנציאציה, Terminal
Differentiation. התא לא יכול להתמיין לדברים נוספים. בתהליך ההתפתחותי קורים שני
דברים: למעלה בציור רואים את הזמן, ככל שהזמן עולה אנחנו עולים ברמת הדיפרנציאציה,
מה זה דיפרנציאציה? התהליך שבו יוצרים cell diversity . המשמעות התאית היא שתא מסויים הופך להיות
תא אחר,יצירת סוגים שונים של תאים. באותו זמן קורה עוד תהליך אמנם עולים
בדיפרנציאציה אבל יורדים ב- potency מתחילים עם תאים שהם Totipotent למשל הבלסטומרים ויורדים ברמת הפוטנציאל ל- pluri -> oligo-> uni -> דיפרנציאציה. שני התהליכים הללו קורים במקביל.
הבלסטומרים הם Totipotent כי הם יכולים לתת הכל, לעומת זה ה- ICM הם pluri לכן בדיכוטומיה הזו שבין Trophoectoderm ל- ICM אנו יוצרים שני דברים
שונים גם מבחינת הפוטנציאל, ה- ICM ייתן עובר, אבל
הבלסטומרים יתנו גם עובר וגם רקמות חוץ עובריות. וה-trophoectoderm ייתן למשל שלייה.
Stem cell: יש כמה קריטריונים ל- Stem cell:
·
היכולת לחדש את עצמו self renewal. קריטריון בסיסי שייך להגדרה הקלאסית
·
יכול לתת לפחות
one cell lineage. יש כאלה שיכולים לתת אחד ויש כאלה שניים
שלושה ארבעה וכו..
·
שייך להגדרה יותר
מתוחכמת Long
lasting cell, הכוונה היא שהתא חי הרבה זמן. השאלה כמה זה הרבה זמן? אין דבר
כזה תא אלמוות!
Embryonic stem (ES) cell: זה יצור מלאכותי! לא קיים בעובר Embryonic stem cells , אם לוקחים רק את ה- ICM ושמים אותם הרקמת תאים ונותנים להם פקטורים שונים אז נקבל ES cell, התאים האלו שיצרו עכשיו מושבות הם ה-ES cell המוצא שלהם הוא מה- ICM, ES cell הם פלוריפוטנטים, הם מסוגלים לתת כל תא בעובר, איך יודעים את זה? עשו ניסוי, לחו בלסטוציט שאותו החזיקו עם פיפטה שמחזיקה את הבלסטוציט ככה שלא יזוז ובעזרת מחט נכנסים לבלסטוציט ומזריקים איזה תא שרוצים במקרה הזה נזריק ES cell מרקמת תאים מזריקים אותו לתוך חלל הבלסטוציט, התאים האלה יעברו אינקואופרציה ל-ICM ואז אפשר לחכות שהעכבר יגדל ואז לבדוק היכן התאים האלה נמצאים, אך יש לסמן את התאים הלו באיזשהו אופן. ככה ניתן להגיד האם תא הוא pluripotent. לא נראה את התאים האלה בשום רקמה חוץ עוברית ולכן התאים האלה הם pluripotent.
ומבחינים בשני סוגים של תאים : EPI = Epiblast ותאים שקרובים יותר לחלל ומפרידים בין החלל ל- EPI תאים אלה נקראים PE = Primitive Endoderm , עוד פעם ישנה חלוקה לשני סוגי תאים שפונדמנטאלית שונים אחד מהשני, ה- EPI ייתן את העובר וה PE ייתן עוד רקמה חוץ עוברית. לכן לא נכון להגיד בשלב הזה שתאי ה- ICM לא יתנו תאים שהם לא עובריים, הם יתנו אבל הפוטנציאל ילך וירד.
שלב G הינו ה- late blastocyst רואים את EPI,PE וכו.., השלב הבא נקרא egg cylinder זו הצורה שעוברת השרשה ברחם השלב שבו העובר נקשר לדופן הרחם. מבחינה מורפולוגית זה לא נראה אותו דבר אבל לא השתנה שום דבר חוץ משינויים מורפולוגיים. אנחנו עדיין בשלב ה- cleavage. נסתכל על ה- PE, התאים מקבלים שמות שונים קצת, המוצא שלהם אבל מה- PE. בבלוסטיציט ישנו ציר שנקרא abemb emb , הציר הזה בצד אחר יהיה העובר כי שם יש את ה- ICM בצד השני לא יהיה עובר, קצה אחד אמבריונלי והקצה השני לא אמבריונלי,זה חשוב לקבוע צירים בתהליך ההתפתחותי.
:
First cell fate decision במצב של שמונה תאים כל תא רואה מצד אחד בלסטומר
מצד שני את ה- zona pellucida זאת אומרת כל תא רואה אותו דבר, לעומת זאת בשלב
המורולה אנחנו מבחינים בין שני תאים שרואים שני דברים שונים יש את ה- outer cell שרואים את ה- zona
pellucid ובלסטומרים ויש את ה- inner
cells שרואים רק בלסטורים. כלומר יש שינוי גאוגרפי שהוא שינוי דרמטי, עד
עכשיו הייתה סימטריה כל תא ראה מה שתא אחר ראה, עכשיו אנחנו רואים שהתאים נמצאים
במיקום גאוגרפי שונה. השלב הזה נקרא first cell fate
decision , ה- inner cells יהפכו להיות ה- ICM וה- outer cells יהפכו להיות ה- trophoectoderm. זו הפעם הראשונה בתהליך
שבו אנו מגבירים שתי אוכלוסיות תאים שונות.
האם זה רוורסבילי? מה המשמעות של הרוורסביליות או לא רוורסביליות?
לשם כך נעשה ניסוי: לקחו earlt blastocyst (EB) ומורולה, מסמנים את התאים האלה בצבע פלורוסנטי שיודע להיקשר לממברנה מבחוץ, ואז מה שעשינו סימנו את ה-outer cells. תחת מיקרוסקופ מפרידים את כל התאים ככה שנקבל תאים מסומנים פלורוסנטית ותאים שלא, התאים שמסומנים פלורוסנטית הם בעצם ה-outer cells ואלה שלא מסומנים הם ה- inner. לאחר מכן יוצרים אגרגטים, לוקחים את התאים המסומנים ויוצרים אגרגט ולוקחים את התאים הלא מסומנים ויוצרים אגרגט ובתוך ביקורת עושים אגרגט מיקס של שניהם. ואז שואלים האם מתפתח מהדברים האלה בלסטוציסט?
32 תאים, רואים תאים פלורוסנטים ותאים לא
פלורוסנטים, עושים אגרגטים ומה שמקבלים זה את הדבר הבא:
רואים אגרגטים של IN ,OUT I- IN+OUT (ביקורת) , רואים שב ביקורת
מקבלים בלסטוציסט יפה. ב-IN רואים תחילה של תהליך
התפתחותי, משהו כמו מורולה שהופך לבלסטוציסט. ב-OUT מקבלים משהו עם חלל אבל
אין ICM וזה השלב הלא רוורסבילי. התאים החיצוניים
מחויבים לטרופואקטודם כי ICM לא נוצר. ישנו שלב של
מחויבות ולכן רואים כי ה-first cell fate decision הוא לא סתם עניין
גאוגרפי, ההפרדה במיקום זה עניין של רגולציה ולא עניין של גאוגרפיה. Outer cells vs. Inner cells Trophoblasts vs. ICM cells בהתאמה.
Second cell
fate decision: מבחינים בתוך ה-ICM בין שתי אוכלוסיות שונות
של תאים Epiblast (EPI) vs. Primitive Endoderm (PE) .
Transcription
factors : ישנם ארבעה, נקראים Oct4
,Nanog,Cdx2 ,Gata4/6 אנחנו בעצם רוצים לדעת היכן הם מתבטאים בכל
התהליך שדיברנו עליו. הם שימשו לנו כמרקרים Transcription
factors נמצאים לנו בגרעין ולכן
הצביעות שלנו יהיו גרעיניות.
במצגת רואים immunostaining ל- oct4 ו- cdx2 אנחנו רוצים לדעת איפה הם
מתבטאים. יש שלב מורולה NB ו-LB. במורולה אנחנו רואים
צביעה של גרעינים הכחול זה גרעינים, וה-cdx2 צבוע בירוק (עם נוגדן)
רואים שהפקטור מתבטא ב-outer cells, ב-MB רואים את ה- trophectoderm ואת ה- ICM וניתן לראות ש cdx2 הוא מאוד ספציפי והוא מתבטא רק ב-trophoectoderm, ב-LB רואים עוד יותר מדויק עוד
יותר חד עוד יותר ספציפי. ICM לא מבטאים cdx2.
Oct4 – ב- MB oct4 מתבטא ברמות גבוהות ב- ICM אבל הוא מתבטא גם כן בטרופואקטודרם ברמות נמוכות יותר. במורולה
הוא מתבטא בכל התאים. בשלב ה-LB רואים בצורה ברורה מאוד
כי oct4 מתבטא ב ICM ואינו מתבטא
בטרופואקטודרם כל תאי הICM מבטאים oct4.
Nanog- גם פקטור שעתוק, במורולה רוב התאים מבטאים את nanog חלק ברמה יותר גבוהה חלק ברמה יותר נמוכה אין צביעה של גרעינים.
רואים ש- nanog מתבטא ברוב התאים ולא בכולם וגם לא באותה
עוצמה. ב- MID רואים שהוא מתבטא רק ב- ICM ולא בטרופואקטודרם, וגם ב-ICM הוא לא מתבטא בכל התאים
ולא באותה עוצמה בכל התאים זה נקרא Salt & pepper expression
.
במצגת רואים צביעה גם של nanog וגם של gata4 בשלב של 65 תאים (E/MB) צובעים את כל התאים ב gata4 שזה אדום ב nanog שזה לבן וגרעינים בכחול.
ב- ICM תאים שמבטאים nanog או gata4 שתי אוכלוסיות של תאים
שלא מבטאות את אותם גנים. תמונה אחרי מאוד דומה, אבל שמים לב שיש קצת שינוי במיקום
בשלב הבא רואים שמקבלים יעוד מסויים בין מתחם של תאים שמבטאים את nanog ומתחם של תאים שמבטאים gata4, ובשלב האחרון והסופי של LB רואים שני מתחמים מאוד
ברורים, מתחם של תאים אדומים שבאים במגע עם החלל לעומת תאים שנמצאים למעלה שהם
מתבטאים nanog. זה מעלה שאלה: איך עוברים ממצב אחד לשני? Gata4 מתבטא באופן ספציפי ב- PE = Primitive Endoderm . יש שתי אפשרויות: תזוזה של תאים אפשרות שנייה היא שהביטוי משתנה , turn on/off של פקטורים
איך זה עובד? מסמנים את gata4 ב-GFP באופן גנטי, ואז עושים Time-lapse microscopy ,
לוקחים עובר מתחת למיקרוסקופ ולעקוב אחריו במצלמה מה קורה לתאים וככה ניתן לראות
איזה מנגנון עובד. במקרה הזה רואים שהתאים מסתדרים לאט לאט, במקרה זה רואים שהתאים
של gata4 מתקרבים לחלל. התנועה הזו היא תהליך דיפרנציאלי
מאוד חשוב כי יוצרים את ה- PE אלו תאים שמורפולוגית
נראים שונים, הם נראים כמו תאי אפיתל. זו לא סתם תנועה או מיקום גאוגרפיץ למיקום
הגאוגרפי יש השלכות וזה בעצם יצירת ה- PE. מתחילים עם ICM שהתאים נראים הומוגניים ה מתחילים לבטא גנים שונים ואז יש מצב של
ייעוד מסויים PE ילכו לכיוון החלל וה- EPI מתרחקים מהחלל.
מרקרים: עד עכשיו התייחסנו לפקטורי השעתוק כמרקרים, עכשיו ננסה להבין את המשמעות של הפונקציה של הגנים האלה מהמורולה לבלסטוציסט. איך בודקים פונקציה של גנים? ע"י LOF גורמים אינאקטיבציה לגן ורואים מה קורה שהגן הזה לא קיים וגם אפשר לעשות GOF של הגן, לוקחים את הגן ומבטאים אותו במקום הלא נכון ובתא הלא נכון. זה סוג הניסויים שננסה לעשות על מנת לענות מה תפקידם של פקטורי בשעתוק.
LOF של oct4- מה שעשו זה נוק אאוט של
הגן בעכבר וניסו לראות מה התפקיד של oct4. רואים קבוצה של עוברים
עם צביעה נגד oct4 . רואים את
ה- wt ורואים הטרוזיגוט ורואים מוטנט. אבל נראה כאילו
המוטנט כן מייצר בלסטוציסט, נראה קטן יותר אבל יש בלסטוציסט עם חלל.
כשמסתכלים על תמונה C (מיקרוסקופ קונפוקלי) רואים את כל העובר ורואים שהמוטנט באמת נראה יותר קטן אבל הוא באמת מייצר בלסטוציסט. השאלה למה הוא קטן יותר? אין פחות תאים, אין שום הבדל בין מספר ה- inner או ה- outer. בתמונה D רואים מורולה , ישנם מוטנטים ויש WT , עד השלב הזה אין בעיה הכל מתפתח טובאבל אם מסתכלים על השלב של ה- implantation , זה השלב במוצאיים מתוך העכברה ממש ברגע ה- implantation ועושים כמה מודיפיקציות. אחת מהן היא לשאול האם יש ICM? והתשובה היא כנראה שאין. לוקחים עובר ושמים אותו על רקמת תאים, מה שרואים הוא שב WTהטרופואקטודרם משתטחים על הפלטה וה- ICM תוך 24 שעות יושבים כגוש של תאים על הטרופואקטודרם. אם מסתכלים על המוטנטים, נוצרים הטרופובלסטים אבל אין לנו ICM, לעובר הזה היה ICM. אחרי 4 ימים רואים שאין ICM במוטנטים וב-WT ה-ICM הולך וגדל ומתפתח והופך להיות Embryonic stem (ES) cell , אחר כך עושים שינוי קטן: מקלפים את הטרופואקטודרם ולוקחים רק את התאים שבפנים, רואים משהו עקרוני , רואים תאים נודדים אלו ה- PE (תאים פריאטליים) ובמוטנטים לא רואים את התאים הנודדים האלו כי אין ICM, ה- ICM נעלם. בנקודה מסויימת בהתפתחות התאים נעלמים.. כל זאת ועוד בשיעור הבא!