bHLH transcription factors חשובים בשלבי התפתחות
ובפעילות תאית בכלל. אופן הרגולציה עליהם
הדוק מאוד ע"י דימריזיה של תת יחידות מהם הם מורכבים.
בקרת ביטוי על transcription factors יותר יעילה
כאשר הם הטרו דיימר ביחס למצב של הומו
דיימר, מכיון שבהטרו דיימר חלק מבקרת הביטוי היא כאשר רק אחד/ חלק מהדימרים שלו
נמצאים בגרעין והשאר בציטופלסמה או שאינם מבוטאים כרגע. במצב של הומו דיימר שני
הדימרים זהים ולכן מבוטאים יחד, מה שמקשה על הבקרה שלהם. הפקטורים קושרים את ה major groove של ה
DNA.
באיור נראה איך האלפא הליקס (בצורת גליל בתרשים)
גורם לדימריזציה ובכך מפגיש חלבון א (כתום) וחלבון ב (תכלת) ליצירת ההטרודיימר.
ישנם מצבים בהם נוכח גם חלבון Id (בסגול) שהוא inhibitor transcription
factors יש לו שני אלפא הליקס אך אין לו את האלפא
הליקס השלשי הנצמד ל DNA ולמעשה ממסך על dimerization domain
transcription factors רבים ש Id
נקשר עליהם מאוד חשובים בדיפרנציאציה של תאים באופן כזה ש Id מונע דיפרנציאציה. ומה ההיפך מדיפרנציאציה?- פרוליפרציה
->סרטן. בתאים שיש רמה גבוהה של Id הוא קושר את ETS ולא מאפשר לו לקשור DNA ולבצע
שעתוק, אך כאשר רמת Id נמוכה מתאפשר שעתוק.
בזמן דיפרנציאציה נראה רמה נמוכה של Id ובזמן פרוליפרציה נראה רמה
גבוהה של Id. בכל
מיני סוגי סרטן יש up regulation של Id , וירוסים הגורמים לסרטן יעשו up regulation ל Id .לדוגמא -יש עליה בביטוי של Id לאחר הדבקה ב KSHV שנראית בצביעה בתאים. ניסו להבין אלו מהחלבונים של ה latency הם
הגורמים לעליה של Id-1 ומצאו שגם v- cyclin וגם LANA מעלים את רמת הביטוי של Id-1 .
קבוצה נוספת של transcription
factors היא Leucine zippers
כאשר יש באלפא הליקס Leucine ( ח.א הידרפובית)
כל 7 חומצות אמינו נוצר מצב שבו צד אחד של
האלפא הליקס הוא הידרופובי מאוד ונקשר לאלפא הליקס הנגדי שגם הוא הידרופובי וכך נוצרת הדימריזציה
יש את ה basic region שעובר את האינטראקציה עם
ה DNA.
במבט מלמעלה נראה ח. אמינו הידרופוביות שפונות אלה כנגד אלה.
ישנם ניסויים שבהם שינו את הרצף של ה Leu zipper לח. אמינו שאינן
הידרופוביות ואז לא התקבלה דימריזציה ולא היה ביטוי של הגן הנבדק. כשהכניסו רצף
שמקודד לח. אמינו הדרופוביות התקבל הביטוי של החלבון הנבדק ומכך הסיקו שמדובר
ברגולציה עם Leu zipper. רק שני חלבונים במצב אלפא
הליקס יכולים להשתלב basic region ב DNA. רק במצב בו שני הפקטורים מצומדים בדימר הם
יכולים להקשר ל DNA.
איך אפשר לבדוק שהחלבונים
עוברים דימריזציה?
1.
ע"י(immunoprecipitation) IP,
2.
Emsa : סימון DNA רדיואקטיבית, לוקחים חלבון אחד
ובודקים אם מתקבל בנד שיפט, אם כן זה מראה שיש קישור ספציפי של החלבון לרצף ה DNA. בסופר שיפט זה כאשר אני בודק גם את הקומפלקס הזה עם נוגדן נגד
החלבון. אם תהיה דימריזציה הקומפלקס (נוגדן-
חלבון -DNA )ירוץ לאט יותר:
דוגמא ל EMSA של שני חלבונים ממאמר של fridman
et al.:
הוא התמקד בAP-1 שזה ה binding site של קומפלקס החלבונים Jun- Fos שנקשרים לרצף TGACGTCA
or TGACTCA. כמו כן ישנו C/EBP
שנקשר לרצף ATTGCGCAAT . הוא יצר כימרה- רצף DNA TGACGCAA שבחלקו מתאים ל Jun- Fos ובחלקו מתאים ל(CCAAT-enhancer-binding proteins) C/EBP כל מונומר
נקשר לחצי המתאים לו וכך ה binding site הוא למעשה משותף לשניהם.
αα- זה הרצף
שקושר רק αC/EBP
Jα- הרצף הכימרי שקושר את Jun- Fos ו C/EBP
כל אחד מהאלמנטים בנפרד נקשר לרצף המוכר המתאים
לו: αC/EBP נקשר בעיקר לרצף αα אך גם ל Jα כי הוא מכיל חלק מרצף ההכרה שלו, jun-fos לא נקשר ל αα כי זה
לא רצף ההכרה שלו אך נקשר חלקית ל Jα מכיון שיש לו אלמנט J ברצף. וכאשר שמו את C/EBP עם jun-fos הם קשרו חזק מאוד
את Jα והתקבל super shift
תוצאות in vitro:
תוצאות in vivo:
כשהרצף הזיהוי לשני הפקטורים היה קטן יותרTGATGCAA–הקישור בין הפקטורים היה חלש יותר.
קישור של JUNB עם basic leucine zipper transcription factor
ATF-like) ) BATF: יש לשניהם Leu zipper , ל BATF יש binding
domain
אבל אין לו את ה activation domain כלומר- עצם זה שיש לו binding domain משמע שהוא תורם לייצוב הקומפלקס, בשונה מ Id למשל, שאינו מכיל את ה binding domain. מלכתחילה חשבו שהתפקיד
שלו הוא לעכב שעתוק עד שגילו שיש לו 3 ח. אמינו מאוד חשובות Glu77, Lys63, His55 שעוברות אינטראקציה עם חלבון IRF וחלבון זה מכיל את ה activation site במקרה זה האוריינטצייה של BATF-IRF חשובה ביותר כי ללא אוריינטציה מתאימה (בתרשים) - לא תהיה משמעות לקואופרטיביות.
סוג נוסף של transcription factor שלהם ישנו מוטיב יחודי הנקרא
zinc finger , יון של Zinc הנמצא בין שני ציסטאינים ושני היסטידינים
מוטיב ה zinc finger יכול ליצור אלפא הליקס
הנכנס לתוך ה major groove של ה DNA
ישנם zinc finger motifs שונים בעלי פעילות קישור
לאלמנטים אחרים כגון יוביקוויטינים.
ישנם סטרואיד רצפטור בעלי Zinc finger כאשר הליגנד נקשר אליהם
הם נכנסים לגרעין התא ומתפקדים כ transcription
factor, אקטיבציה של הורמונים רבים מתבססת על העיקרון הזה:
ישנם transcription factors בעזרת ליגנד חיצוני יהיו קואקטיבטורים (כגון (NRA,
HAT, HMT ישנם שבתוספת ליגנד יהיו קו רפרסורים (למשל nfKb) וישנם שגם ללא ליגנד יהיו קו רפרסורים (NCoR
or SMRT).
בקרה נוספת על הtranscription factor היא זרחון, ללא זירחון לא יהיה קישור לDNA או
קואופרציה עם פקטור נוסף, יש transcription factors שרק
כאשר מורידים מהם את הפוספט הם יכולים לקשור פקטורים אחרים או DNA ולהתחיל שעתוק.
סטרואיד רצפטורס- החלבון נמצא בציטוזול ורק ע"י קישור לליגנד הוא נודד
לגרעין ונקשר לdna.
יכול להיות חלבון ממברנלי שכשאר הוא מקבל סיגנל (ע"י ליגנד) הוא
עוזב את הממברנה וקושר .DNA
nfkB באופן שיגרתי קשור לו inhibitor שנפרד ממנו כאשר מתקבל
סיגנל ואז הוא נכנס לגרעין הופך להיות transcription factor פעיל. ישנם חלבונים שאופן הרגולציה שלהם הוא שה repressor domain הוא חלק מהם.
GAL4DBD- הוא transcription
factor. ברמה הבזלית הוא פעיל מעט מאוד. כאשר עושים
לו פיוז'ן עם VP16 הפעילות
שלו עולה דרמטית, כאשר לוקחים את החלבון השלם- לא רואים פעילות של transcription
factor למרות שהוא גם transcription
activator, אבל כאשר לוקחים אותו עם ח.א 1-115
מקבלים transcription activation מובהק.
כאשר לוקחים עם ח.ח 147-249 לא מקבלים שעתוק. כך ע"י חיתוך וביטוי של חלקי
החלבון הבינו איזה איזור בחלבון מבצע repression ואיזה
איזור מבצע activation.
Activation domain -VP16
חשוב לזכור:
לסיכום, סוגי transcription
factors עליהם דיברנו:
