סופר אינהנסר

על מנת לבחון אזורים גנומים, מכניסים אותם תחת פרומוטור ומבצעים הליך RNA seq באילומינה (הפקה של  RNA ויצירת ספריה של cDNA וריצוף (next generation seq) מאפשר לראות איפה יש ביטוי, ככל שהאינהנסר משפיע על הטרנסקריפציה יהיה לנו יותר ביטוי. מאפשר whole genom seq וזיהוי האינהנסר על פי ביטוי של RNA. (אין צורך בזיהוי האינהנסר אלא רק באיך הוא השפיע)

ניתן לבדוק גם באמצעות Chip seq-  שימוש בנוגדן כנגד חלבון או Histone modification כל ה DNA שירד שולחים לNGS

לאינהנסרים יש מרקר אופייני- H3K27ac

היסטון מרקס- רגולציה על גנים דרך אינהנסרים. שונה בין עכבר לאדם למרות שהפרומוטור מאוד דומה, בר המעיד על השפעת האינהסרים על ביטוי.

  Mediator- wholoenzym , קומפלקס מאוד גדול- פולימראז+מדיאטור. מקשר בין האקטיבטור לבין הRNA פולימראז.

מאמר מNATURE  2012 whole genom chip seq בשלושה קווי תאים stem cells, macrophages  ועוד אחד עלfactors and histone modifications chromatin remodeling התמקד במרקרים לטרנסקריפציה:

 

1.     H3K4me3- מודיפיקציה שנמצאת בדכ על פרומוטורים בדכ בתחילתו

2.     POLIII- מרקר המעיד על קישור אבל אינו מאפשר לדעת אם יש או אין טרנסקריפציה.

3.     H3K4me1- מרקר של אינהנסר. האנהנסר יכול להיות פעיל או שכבר עבר איזו אקטיבציה.

4.     H3K27ac- הוא המרקר הכי ברור לטרנסקריפציה, והוא מסמן לנו אינהנסרים.

5.     P300- קואקטיבטור חשוב, מסייע ביצירת גישור בין פקטורים ולעיתים משמש גם כמדיאטור

6.     CTCF - כשיש לולאה עם אינהנסר ופרומוטור, את הלולאה אוחז קוהזין, CTCF BINDING SITE  תמיד יהיה בלולאה עם האינהנר והפרומוטור והוא יביא את הקוהזין  

Pose – מצב בו יש מרקר של H3K4me3 אבל אין H3K27ac, יש  H3K27me (repressive mark), יש פולימראז אבל אין טרנסקריפציה.

אינהנסר וסופר אינהנסר

פקטורים ידועים הדוחפים פיברובלסט להיות stem cell :Oct4, Sox2, Nanog.

באינהנסר רגיל יש פיק 1 ובסופר אינהנסר יש מספר פיקים ,הוא ארוך יותר (פי 1000 ויותר) ויש הרבה binding sites..

המאמר הביא לידיעה את החשיבות של Klf4 וEsrrb בשמירה על stem cels  בנוסף לפקטורים הידועים על ידי כך שגם הם מבוקרים ע"י הסופר אינהנסרים.

סופר אינהנסרים

-        נמצאים יחסית מאוד קרוב לגן שהן מבקרים (לפני או אחרי), לעומת אינהנסר רגיל (typical).

-        הינו סוג אחר של אינהנסר, בעלי אפיון המתאים לאינהנסר רגיל ומאפיינים נוספים .

בתאים רגילים לאחר התמיינות יש כל מיני השתקות אופייניות לרקמה בניגוד לStem cells בהם פרומוטורים נמצאים בpose ו"מחכים" לביטוי על פי דיפרציאציה. בתאים סרטניים יש שינויים שונים מתאים רגילים וstem cells.

גנים מבוקרים על ידי סופר אינהנסר- פקטורי שיעתוק חשובים. לדוג בstem cells  (oct4,sox2) החלבונים המתבטאים מאותם גנים גם מבקרים את הביטוי feedback loop. במקרופאגים מצאו מדיאטור, myoD , cvp תחת רגולציה של סופר אינהנסר

מאפיינים של אזורים של סופר אינהנסר

1.     אזורים של אינהנסרים רגילים- קושרים חזק מדיאטור קושר הרבה על סופר אינהנסר.

2.     סופר אינהנסרים מאוד רגישים ומתפרקים בקלות אם משהו בפקטורים הקשורים משתנה. השתקה של oct4 לא השפיעה על אנהנסרים רגילים אבל כן השפיעה על סופר אינהנסר (RNA seq)

 

1.     מדאטור, בסופר אינהנסר נקשר חזק יותר, ניתן לראות פיק גבוה יותר. בהשתקתו, גנים המבוקרים על ידי סופר אינהנסר יושפעו מאוד בניגוד לכאלה המבוקרים על ידי אינהנסרים רגילים.

2.     זיהוי גנים המבוקרים על ידי סופר אינהנסר הוא יחסית קל מאחר והסופר אינהנסר נמצא יחסית קרוב לגן המבוקר (להוציא את myc שהוא יוצא דופן) בניגוד לאינהנסר רגיל ובנוסף, גנים המבוקרים על ידי סופר איניהסרים מתבטאים חזק יותר.

3.     בכל סוג תאים לסופר אינהנסר יש ספציפיות לcell identity. יש אינהנסרים רגילים המשותפים למספר סוגי תאים. בסופר אינהנסרים נמצאו בודדים השותפים בין קווי תאים שונים, מה שמעיד על ספציפיות הבקרה בהתאם לאפיון הרקמה או השתייכות התא.tissue specific

 

נמצא כי ישנם אונקוגנים המבוקרים על ידי סופר אינהנסרים

אפיון סופר אינהנסר:

-        יותר ארוך

-        יותר מדיאטורים קשורים וקישורים מאוד חזקים.

-        בקרה על cell identity.

-        מבקר אונקוגנים ידועים.

-        יותר ביטוי

במצבי סרטן- נמצא שיש סופר אינהנסר שהם up regulated. עלולה להיות מוטציה באינהנסר.

מוטציות:

סניפים האופיינים למחלה, 7% מהסניפים נמצאו על coding regions.

ישנם סניפים שנמצאים בתוך אינהנסר

במחלת האלצייהמר לדוגמא  ישנם הרבה סניפים הנופלים בסופר אינהנסרים האחראים על אפיון תאי המח.

במחלות קרדיווסקולריות- בסופר אינהנסרים בתאים בלב.

ההבדל בסניפים באינהנסרים ובסופר אינהנסרים ניתנים לזיהוי על פי אם ניתן לדעת לפי הסניפ מה היא הרקמה בשל השפעת הסופר אינהנסר על cell identity.

התגלו עד כה כ800 סופר אינהנסרים.

 

ההבדל בין סופר אינהנסר לאינהנסר רגיל:

גודל ( פי 1000 ויותר)

Density- כמה פקטורי שעתוק קושרים וכמה מאותו פקטור שעתוק קושרים.

יכולת איקטוב שעתוק

רגישות לפירוק

חשיבות לcell identity

BRD4 -  קואקטובטור אשר מגייס קומפלקסים נוספים כמו גם את המדיאטור. נמצא גם הוא על סופר אינהנסר

ישנו דראג שנקשר לBRD4  ומונעים ממנו להקשר ל H3K27ac. עיכוב גידול של תאים סרטניים.

סופר אינהנסר- ככל שעולה הריכוז בדראג יש ירידה בביטוי של BRD4 כצפוי (איו דרגדציה רק חסימת פעילות) בעקבו הדראג התאים לא גדלים לדוג' ירידה בביטוי של myc.

הדראג משפיע בעיקר על סופר אינהנסר- ירידה בקישור של המדיאטור לסופר אינהנסר- ירידה בביטוי אונקוגנים. בפרומוטורים אין הרבה הבדל בטיפול בדראג.

סופר אינהנסרים מבוקרים על ידי BRD4.

וירוסי הרפס מחוללי סרטן.

המצב הלטנטי האופייני לוירוסי ההרפס מאפשר קיום הDNA ,מעין פלסמיד, הויראלי בגרעין ללא אינטגרציה הוא מתחלק עם חלוקת התא.

 

KSHV - הדבקה בבעלי מע' חיסון כושלת ברב המקרים יפתחו סרטן.

EBV-  גורם למחלת הנשיקה, נפוץ באוכ. הראשון להתגלות כמחולל סרטן. בעל 3 מצבים לטנטים:

הדבקה דרך רוק, בתאי אפיתל- ליטי והדבקה של B cells עובר לליטי סוג 3 (ביטוי הרבה חלבונים אונקוגנים) מע' החיסון אינה מאפשרת את סוג 3 ולרב אחרי הדבקה יהיו בעיקר תאים בלטנטי סוג 1 בו מתבטא רק EBNA1. איקטוב של פקטורים על ידיה וירוס מאפשר איתור של פקטורים בגרעין.

יש מעט פרומוטורים שהפקטורים נקשרים אליהם לעומת האינהנסרים אליהם נקשרים הרבה פקטורים.

 

דווקא באינהנסרים לא ראו איזורי קישור ל NFKB(חלבון המבקר טרנסקריפציה, עובד בקומפלקס), כן נראו של פקטור שיעתוק FOXM1 המגייס את NFKB. בהעדר פקטור השעתוק יש ירידה בביטוי.

 

EBNA- איזורים שהוא קושר- סופר אינהנסרים שמשפיעים על גנים חשובים .4 החלבונים של EBV  נקשרים לאותם סופר אינהנסרים. בעבודות קודמות הראו שכל אחד מהחלבונים חשוב לטרנספורמציה והעדרות של כל אחד מהם גורם לכך שלא תהיה טרנספורמציה.

 

ביטוי גנים של סופר אינהנסרים גבוהה, תאים מודבקים ביטאו גנים ברמה גבוהה יותר.

טיפול במעקב של BRD4 בתאים מודבקים נראה עיכוב בגידול התאים. תוך כך ירידה בביטוי של myc.

Mir155- יותר קריטי ל NFKB (משפיע על ביטוי של mRNA)

Myc- יותר קריטי לEBNA2  (השתקתו מורידה ביטוי myc)

שניהם חשובים לביטוי גנים המבוקרים עי סופר אינהנסרים.

 

חלבוני EBNA וNFKB, STAT5 ויוצרים איזשהו  EBVסופר אינהנסר.

נוצר הרבה H3K27ac מעלה טרנסקריפציה של כל מיני אונקוגנים.

 

Myc מתבטא ביתר בתאים מודבקים בKSHV  ו PEL cells, רצו לבדוק האם הדראג ישפיע על cell survival- נראה שאחרי הטיפול בדראג יש ירידה בחיות התאים. כמו כן ירידה בביטוי חלבונים המבוקרים עי myc.

נוירובלסטומה- נמצא סופר אינהנסר של LMO1 (non oncogene)בעל מוטציה. השינוי באתר EAEAA נוצר GAGAA  אתר קישור לפקטור שעתוק גורם לביטוי מוגבר LMO1. בשל המוטציה נוצר אתר קישור לפקטור שעתוק שלא היה קיים קודם.

המוטציה מגייסת את GATA3 שלא אמור לקשור ,שמפעיל את הסופר אינהנסר ומשפיע על טרנסקריפציה.