אפיגנטיקה

האפיגנטיקה מתארת את השינויים העוברים על גבי ה DNA  המשפיעים על אופן ביטוי הגנים.

DNA Methyl transferase  DNMT- מבצע מתילציה על ציטוזין ובכך גורם להשתקת הביטוי

5’ CpG 3’ 3’ GpC 5’

ניתן לראות בתרשים שלא כל בסיסC  עובר מתילציה אלא רק  C  הנמצא לפני G – אנו קוראים לזה CpG (p- for phosphate) /. בגלל שרצף CpG הוא פלינדרום- כלומר הוא זהה משני הכיוונים 5-3 או 3-5 המתילציה שבו נשמרת גם בחלוקת תא כאשר הגדילים נפרדים,  והאנזים DNMT ידע לבצע מתילציה גם בגדיל החדש.

 CpG יחסית נדיר בגנום יונקים, קצה 5 של הפרומוטרים של כל housekeeping genes , של כ 50% מהפרומוטרים ושל מספר גנים ספציפיים לרקמות מסויימות מכילים קלאסטרים של CpG הנקראים CpG islands. כמו כן רוב הפארזיטים ורצפי DNA  חוזרניים (repetitive elements) רטרו וירוסים ורטרוטרנספוזונים מכילים CpG islands.

הגנום עבר סלקציה שלילית של CpG- עקרונית היינו מצפים למצוא CpG בשכיחות של 1/16 לאורך הגנום (¼ לבסיס C כפול ¼ לבסיס G) אך למעשה השכיחות של CpG הרבה יותר קטנה. זאת משום שדאמינציה  מתרחשת באופן ספונטני בגנום וכך ציטוזין הופך לאורציל, מע' התיקון של ה DNA  מזהה את זה כטעות , מסירה את האורציל ומכניסה ציטוזין. אך כאשר 5’Methyl-cytosine  עובר דה אמינציה הוא הופך ל Thymine, ואת זה מע' התיקון לא מזהה כנזק.

כך קרה שהרבה אזורים שהיו CG הפכו ל TG. האזורים שנשארו  בהם CpG islands הם פרומוטרים והם לא עברו מתילציה. בסרטן פרומוטרים מסויימים עוברים מתילציה > השתקת גנים.

Genomic imprinting:

זוהי צורת תורשה שאינה מנדליאנית קלאסית כלומר היא איננה מעורבת ברצף הDNA  עצמו אלא קשורה למודיפיקציות שעל גבי הרצף. אם לדוגמא גן מסויים באלל האבהי עבר imprinting אזי הגן באלל האימהי הוא זה שיתבטא. וכן להיפך. ה imprinting עצמו היא למעשה מתילציה של DNA  או של היסטון. כשרוצים לדעת האם גן מסוים הגיע במקור מהאב או מהאם, בשלב הכנת הגמטות תתבצע השתקה בתא הזרע וכך הגן מהאם יבוטא (או להיפך- השתקה בביצית והגן באלל האבהי הוא שיבוטא). אם שני האללים ממקור אבהי או ממקור אימהי אינם אקטיביים (ממותלים) אז גם אצל הצאצא לא יהיה ביטוי. הבעיות מתחילות כאשר לצורך העניין  הגן מאלל אבהי ממותל והגן ממקור אימהי מוטנט, הגן שיתבטא יהיה מוטנט- ונוצרת מחלה.

בשלב הרפליקציה ישנם שני הגדילים הישנים עם המתילציות על גביהם ושני הגדלים החדשים ללא מתילציות. מצב זה נקרא Hemi methylated

קיימים בתאים אאוקריוטיים 3 סוגי DNMTs: DNMT1, DNMT3A, DNMT3B הם מכילים גם את ה regulatory domain  וגם את ה catalytic domain

רצו לבדוק את הפעילות של האינזימים הללו:לקחו שני אנזימי רסטריקציה  MspI   שמזהה רצף CCGG וחותך בין אם יש מתילציה על רצף הזיהוי ובין אם אין מתילציה, ואת האנזים HpaII  שמזהה גם את הרצף CCGG  אך רגיש למתילציה, כלומר שמידה ויש מתילציה ברצף הזיהוי הוא לא יחתוך. באינקובציה הניחו את רצף ה  DNA  עם כל אחד משלושת methyl trarnsferases הנ"ל , לאחר מכן הוסיפו את אנזימי הרסטריקציה  MspI   (כקונטרול) או HpaII   וראו ע"פ גודל הבנדים שהתקבלו של DNMT1, DNMT3A, DNMT3B עם יש פעילות של מתיל טראנספרז. במילים אחרות המתילציה על רצף הרסטריקציה לא איפשרה ל HpaII לבצע חיתוך ולכן התקבלו בנדים ארוכים  (ב kb כמובן..)

ניסוי נוסף שבו בדקו איזה מהנזימים חשוב בשלב הרפליקציה-( שוב, זהו שלב שבו גדיל אחד ממותל וגדיל שני לא). לקחו un-methylated DNA, hemi methylated DNA & completely methylated DNA ובעזרת סמן רדיואקטיבי עקבו אחר פעילות המתיל טראנספראז.

על פי התוצאות נראה ש MT1  הוא החשוב בשלב הרפליקציה מכיוון שהוא היחידי שמבדיל בין hemi methylated  ובין completely methylated . חשוב לשים לב שציר Y  ב MT1 מגיע עד 200, מה שאין כן בשאר האנזימים. זה מדגיש עד כמה האנזים MT1 פועל בספציפיות ל hemi methylated. אז כפי שציינו DNMT1 הוא בעל זיקה חזקה מאוד ל hemi methylated. עכברים עם DNMT1  מושתק לא מתפתחים ומתים עוד בשלב העוברי. DNMT1  למעשה מבצע maintenance  על הDNA   שישאר במצב methylated היכן שחסר. UHRF1 ו PCNA  עוברים אינטראקציה עם DNMT1 . UHRF1 נקשר H3K9- methylated  שהוא אסוציאטיבי להטרוכרומטין, וכך באזור שהוא methylated  ברמת ההיסטונים מתבצע גם maintenance להיסטונים עצמם כדי שהמתילציה תשאר גם ברמת ההיסטונים ברפליקציה. SuvR עושה מתילציה על ההיסטונים  החדשים שבסביבתם הקרובה יש DNA שעבר מתילציה. יש מודל נוסף שלפיו UHRF1 מגייס יוביקוויטינים להיסטונים וזה עוזר להבאת DNMT1 לאתר לביצוע מתילציה.

בדקו כמה מתילציה נשארה לאחר נוק אאוט של DNMT1 בתאים ונמצא  שיש ירידה רק של 20% במתילציה כשעשו נוקאאוט ל DNMT3Bb איבדו 3% מהמתילציה וכשעשו לשניהם נוק אאוט, איבדו 100% מהמתילציה. מה שמשתמע מכך שגם ל DNMT3b יש פעילות של maintenance וכשמאבדים את שניהם המתילציה אובדת במלואה.

שיטה נוספת לבדיקת מתילציה היא שימוש בשיטת bisulfite conversion, הביסולפיט מסיר בסיס C  והופך אותו לU  אך בסיס C  ממותל הוא לא מחליף. בשלב הבא נבצע PCR  והU  יהפוך ל T .

כל מה שצריך זה לתכנן זוג פריימרים שיתאימו למצב הרגיל וזוג פריימרים שמתאימים למצב ש C הפך ל T, שיטה זו נקראת methylation specific PCR  , תהיה אמפליפיקציה רק אם היה שינוי של הנוקלאוטידים. שיטה נספת היא bisulfite sequencing ביצוע PCR  עם פריימרים שלקוחים דווקא באיזורים AT reach , ביצוע אמפליפיקציה, וקלונינג של הרצפים האלה לחיידקים- הפקת הפלסמדים  ומרצפים . הרעיון הוא שהפריימרים לא מבדילים אם יש או אין מתילציה. היום כשיש כבר NGS  ניתן לראות תוצאות על כל הגנום אבל צריך לקרוא את כל הגנום 10 פעמים ע"מ לקבל תוצאה ודאית כי בתוך האוכלוסיה קיימת שונות.

נוקאאוט ל de- novo DNMTs:

כשביצעו נוק אאוט ל DNMT3a בעכברים, התקבלו עכברים קטנים יחסית שמתו בגיל 3 שבועות (A), בנוק אאוט ל  DNMT3b התקבל פנוטיפ מאוד ברור כבר בשלב העוברי, והעוברים לא שרדו (B). בדאבל נוק אאוט התקבל איזה מין עובר מוטנט לגמרי (E), תוצאות אלה ממחישות את החשיבות של DNMT3a  ושל DNMT3b בהתפתחות עוברית.

גם כאן בדקו איזה methyl transferase  פעיל בתאי העוברים בעזרת מבחן ה HpaII , (תזכורת- אנזים רסטריקצייה שלא חותך במידה ויש מתילציה באתר הרסטריקציה), ניתן לראות שב southern blot התקבלו בנדים גדולים (מבחינת kb) כש Dnmt3a מושתק –ז"א שלא היה חיתוך כלומר היה methyl transferase כלשהו שביצע מתילציה, זאת לעומת Dnmt3b שבהשתקתו מתקבל חיתוך רב (הרבה בנדים) ומכאן משתמע שכאשר Dnmt3b לא מבוטא אין אנזים שיבצע את המתילציה במקומו בשלב העוברי. ומכאן ש Dnmt3a פחות חשוב בהתפתחות העוברית.

 Dnmt3a ו Dnmt3b הם de novo methyl transferases כלומר הם ממתלים פאטרן חדש בשלב העוברי אך יש להם פעילויות שונות, בשונה מ DNMT1  שהוא maintenance methyl transferase השומר על המתילציות הקימות, בחלוקת תא וכד'.

כאשר איזורים חוזרניים שאמורים להיות ממותלים עוברים רקומבינציה לאיזורים אחרים בגנום ושם הם לא ממותלים זה גורם לאי נורמליות ולמחלות מסוימות. למשל ב ICF syndrome איזור ה  satellite  שבדר"כ ממותל בכבדות, לא ממותל כלל בכל הרקמות.  מתאפיין בחוסר יציבות כרומוזומלית .

 

#לעובר יש פאטרן חדש של מתילציה כי בעובר מתבטאים גנים שלא התבטאו בתאי המין לפני הזיגוטה.

מה השפעת כמות ה DNMT  על סרטן? ישנן תוצאות שונות הסותרות אלה את אלה, עם ירידה ברמת DNMT1  נמצאה ירידה ברמת הסרטן, קבוצה  נוספת מצביעה על קשר חיובי בין Dnmt3a וסרטן- כלומר עליה בביטוי גורמת לעליה בסרטן, ומצד שני קבוצה אחרת מראה שדווקא בנוק אאוט של Dnmt3b יש עליה בסרטן.

מה למעשה מתרחש כאשר אזור בDNA  ממותל? כאשר יש מתילציה ה transcription factors לא מזהים את הפרומוטרים (בדומה לאנזים הרסטריקציה HpaIIשראינו לעיל). לעומתם ישנם פקטורים שנקשרים דווקא לאזורים ממותלים ב DNA  הם בקומפלקסים גדולים (בתמונה) עושים רפרסיה לגנים ממותלים.

בסוגים מסויימים של סרטן מתקבלים פרומוטרים אחרים שעוברים מתילציה וזה מאפשר לזהות את הסרטן בדיוק רב יותר- ע"י הפקת DNA . בסוגי סרטן מסויימים  DNA מתאי סרטן cell free DNA מתשחרר לזרם הדם , ניתן להפיק את ה cfDNA  הזה ולבדוק מה מצב המתילציה . לעיתים הכמות של ה cfDNA  הסרטני בדם ממש מזערית  אבל אנליזה של ה cfDNA  יכולה לתת פרוגנוזה מדוייקת . מתילציה היא מאוד יציבה ונשמרת לאורך שנים רבות בתנאים היום יודעים לזהות מתילציות בגנום של האדם הניאנדרטלי.

יש גנים שעוברים השתקה בסרטן, כמו למשל בחלבון P16 שהוא tumor suppressor  נמצא שהוא עובר מתילציה ולכן לא מבוטא. מושתק גם בתאים מודבקים ב KSHV.

השוו מתילציה בתאים מאנשים בריאים וחולים בסרטן ונמצא שיש הבדלים מובהקים בין התאים השונים. בתאים בריאים (בכחול) באזור של CpG islands יש נפילה ברמת המתילציה ומחוץ ל CpG islands  רמת מתילציה גבוהה. יש גבול מאוד ברור ב CpG island . ובסרטן (באדום) הגבולות האלה מיטשטשים. שינוי מובהק ברמת המתילציה בתאים סרטניים.

בשיטה זו ניתן היה לזהות איזורים עצומים שבהם יש שוני ברמות המתילציה ולפי התוצאות האלה הם הגדירו בעקבות ה CpG island גם  shelf and shore על פי ריכוז המתילציות ביחס לגן.

מצאו שיש גנים שבסרטן הם עוברים היפו מתילציה וישנם גנים שעוברים היפר מתילציה כך שזה תורם להתפתחות הסרטן.

לסיכום ביניים קצת סדר בתרשים הבא:

רוב ה DNA  ממותל למעט מספר איזורים ספציפיים שמוגנים מפני מתילציה

ניתן לטפל ב 5-Aza כדי לבטל מתילציה, ובכך מנסים להחזיר תאים פגועים למצב ביטוי תקין. יש כמה  הצלחות בתחום טיפולי זה במספר סרטני דם. 

איך בעצם ה DNMTs ממתלים איזורים ספציפיים? אז קודם כל ה  DNMTs נקשרים לקומפלקסים שמגייסים אותם ע"ג האיזורים המיועדים לכך. בנוסף האנזימים שמוסיפים את המתילציות על H3K9כגון G9a או Suvr הם עצמם קושרים את ה DNMTs או ע"י היקשרות ל HP1 הנקשר ל H3K9me3 . בתרשים להלן סדר הפעולות בתהליך:

למעשה DNMT3 לא עושה את ההשתקה אלא רק מקבע אותה.

DNMT2 לא ידוע מה בדיוק עושה, DNMT3L ככל הנראה מבקר את פעילותם של Dnmt3a+b.

מאיר בדק אלו גנים עוברים השתקה בנוכחות ביטוי של LANA - בתאי TIME LANA  מול תאי קונטרול   TIME BABE. הגנים שעוברים השתקה נמצאו כגנים שעוברים מתילציה. ע"י הוספה של 5-AZA נמצא שההשתקה התבצעה ע"י מתילציה. בריצוף על איזור H-cadherin (CDH13) promoter  בשיטת bisulfite  נמצא שבתאי TIME-LANA    מתחילה להצטבר מתילציה ביחס לתאי הקונטרול שבהם אין מתילציה כלל וביחס לתאי BCBL1 בהם יש  KSHV (תרשים ימני) ע"י methylated specific PCR מצאו שהגן E-cad לא ממותל ב TIME-BABE  אך ממותל ב TIME-LANA (תרשים שמאלי)

נמצא ש LANA נקשר לפרומוטרים שעברו רפרסיה LANA  גם עובר אינטראקציה עם Dnmt1, Dnmt3A and Dnmt3B in-vitro  ובעיקר עם Dnmt3A in-vivo.   LANA גם שינה את הלוקאליזציה של DNMT3a . וגם מגייס את DNMT3a  כדי לבצע רפרסיה על Cyclin D2 . LANA  גם יכול לגייס פעילות של DNA methyltransferase activity . מאיר עשה ניסוי נוסף בו הוא החדיר פלסמיד לתוך תא מבטא LANA או Dnmt3a לביקורת חיובית, הוא הפיק את הפלסמיד וניסה לחתוך עם הפלסמיד HpaII שכזכור לא חותך באתר רסטריקציה אם יש בו מתילציה. ומצא שפעילותו של LANA  היתה דומה מאוד Dnmt3a  - כלומר שניהם מובילים למתילציה לפלסמיד in vivo. וכששניהם מתבטאים יחד הם מעצימים את המתילציה- כלומר עובדים בקולבורציה, בכך ש LANA מגייס את Dnmt3a  .

לסיכום:

כמו KSHV, גם וירוסים סרטניים נוספים נוקטים באסטרטגיית המתילציה בינהם נמצאים HBV, HCV, HPV   ועוד.