מבוא לשעתוק-יחידת הפולימיראז

התאים שונים למרות שהם מכילים אותו דנ"א ,ולכן זה קשור לביטוי גנים ,כי תא כבד נראה כמו תא כבד ותא עצב נראה כמו תא עצב ,ותראו איזה יופי שלמרות שזה אותו דנ"א שנמצא בתאים השונים יש הפעלה של סט שונה של דנ"א וזה מה שגורם לתא עצב להראות כמו תא עצב וכדו'.

 

אנו רואים סיגנאלים שונים בתא  signal transduction(אין signal transduction שלא מגיע לכבד  ואם הוא לא מגיע לכבד אז זה מעיד על מוטציות בסיגנלים שיכולים לגרום למחלות) - יש   Input שנכנס לגרעין של התאים והוא עושה אינטגרציה ומחליט איך להגיב. יש הרבה גנים שהם לא מופעלים על ידי אותו פקטור שעתוק ,הרבה מאוד פקטורים הם צריכים להיקשר לאתר קישור ולכן הוא יכול לקחת Input מכל מיני מסלולים וזה יקבע לי בעצם האם הגן יתבטא או לא .

בתאים אאוקריוטיים הדנ"א ארוז בנוקלאוזומים,ויש כל מיני רמות של ארגון.

שלב 1 –לגרום לכרומטין להיות נגיש לטרנסקריפשיין שנראה.

שלב 2 – בקרה –לקבוע איזה גנים יתבטאו בזמן נתון ,תוך כדי שעתוק יש ספיליסינג בכדי לבטא טרנסקריפט שונה

שלב-3 : ואחר כך יש לנו בקרה של יציאת הרנ"א מהגרעין לציטופלזמה .

שלב 4 :,ויש בקרה של יציבות הרנ"א .

שלב-5 :ובסוף יש את התרגום .

שלב-6 :ויש את הבקרה של יצירת החלבון .

בקורס זה נתמקד בשלבים גרעיניים של ביטוי גנים .

POL1 עושה שעתוק לרנ"א ריבוזומלי ,  28s 18s 5.8s.

POL2 עושה שעתוק לכל ה-mRNA שמקודדים לחלבון +small nuclear RNA +microRNA.

POL3 עושה שעתוק מאוד מדויק ,והוא מתחיל באופן מדויק ומסיים באופן מדויק ,והוא משעתק

5s rRNA and tRNA.

ואם אנחנו רוצים לעשות שיתוק של גן כלשהוא ,אנחנו משתמשים ב shRNA שמיוצר על ידי POL3.אבל אם עושים את השיתוק לפי microRNA אז זה לפי POL2 ואלה שתי שיטות שונות.

תת יחידות של פולימיראזות –יש הרבה(מצוי בטבלה)    ויש הרבה בגלל העניין של רגולציה, וגם בכדי שיהיה לי הרבה targets  לחלבונים בכדי לתקוף אותם.

רנ"א פולימיראז-יש אתר פעיל+clamp  כאשר הדנ"א נכנס ואז ה- clampנסגר עליו.

אם מדברים על חיידקים אז יש לנו את הפולימיראז+סיגמא פקטור שהוא נקשר לפולימיראז ומביא אותו לאן שצריך לעשות שעתוק .

פקטור סיגמא מכיר את ה-TATA BOX,ועוד רצף שנמצא 35 בסיסים transcription statrt site .

כאשר יש promotor  הסיגמא אומר לפולימיראז שצריך לעצור ,לפתוח את הגדילים ולעשות שעתוק.

Bacterial promoters : כאשר אומרים לנו -10 זה יחסית  ל transcription statrt site והוא תלוי באיזה כיוון לכן רושמים -\+.

פולימראז RNA וקומפלקס השיעתוק

בתאים אאוקריוטיים:צריך להכין את promotor בכדי שהפולימיראז יגיע.

General transcription factor :חיוניים לשעתוק בכל מקרה וכאשר הם קושרים את ה promotor הם גורמים לפולימיראז להגיע ולהתחיל עם השעתוק .

 

סוגי General transcription factor: TFIID מכיל TBP(TATA Binding Protein) הוא חיוני שקושר את ה-  TATAשנמצא ב-, promotor ,וגם מכיר אלמנטים בפרומוטור שהם לא TATA BOX והוא שונה משאר ה- General transcription factor שהוא ספיציפי ומאפשר קישור פולימיראז לפקטורי שעתוק באופן ספיציפי ,והוא נמצא בתוך קומפלקס גדול שנקרא TFIID עם הרבה תת יחידות  :  TAFs שעוברים אינטרקציה עם  co activators והם קושרים Downstream to TATA BOX.

והפקטור הבא שצריך להגיע למערכת הוא TFIIA – שהוא קושר TBP ומייצב אותו על ה- TATA.והוא מעכב את הרפרסיה.

ובסוף מגיע TFIIB והוא עושה ייצוב של הקומפלקס(והוא קושר שני אזורים שהם מסביב ל-TATA BOX)והוא כמו כף שכאשר הוא קושר את הדנ"א הוא מכופף אותו ובכדי לראות את זה צריך לעשות את זה ב-30 מעלות כי הוא מיישר אותו וגורם לו להתקפל ,והוא זה שיביא את הפולימיראז בעצם,והפולימיראז מגיע ביחד עם TFIIF ,לאחר הגעת הפולימיראז יגיע לנו TFIIE+ TFIIHשה- TFIIE שהפעילות שלו היא לבקר את הפעילות של  TFIIH –שהוא קריטי להתחלה של השעתוק,ורק לאחר שיגיע TFIIH קורים לזה P =קומפלקס מוכן לעשות שעתוק.

יש כל מיני פקטורים כמו ... שקושרים את TBP ומפריעים לו לקשור כל מיני TATA על מנת לבקר אותו .

ל- TFIIAיש 3 פעיליות:

1.הליקאז-פותח שני גדילים.

2. . ATPase

3.קינאז-הוא מזרחן את ה-CTD של הפולימיראז ומאפשר לו לנוע.

לפולימיראז יש אזור שנקרא CTD שמכיל 7 חומצות אמינו שחוזרות 52 פעמים באדם.

בשלב של השעתוק:סירין 5 עובר פוספורלציה וזה התפקיד של ה- TFIIHואז הפולימיראז יכול להתקדם ויש שלב הארכה,

Promotor clearance –מתחיל הפולימיראז לרוץ אבל הוא עדיין לא בשלב של הארכה בהמשך יש פוספולרציה על סירין 2 וכך פולימיראז עובר הארכה וכך הוא יכול לרוץ לאורך כל הדנ"א.

שאלה:האם המטרה של זה היא למנוע קישור לא ספיציפי של הפולימיראז ? בהתחלה פולימיראז לא מזורחן ,ותוך כדי שעתוק יש ספלייסינג .

. TBP-associated factor 1 (TAF1) and TAF2 bind the initiator element (Inr). TAF6 and TAF9 bind the downstream promoter element (DPE).

70% מה- Promotorאין להם את ה- TATA BOX,ולכן ,תפקיד ה-TAF מאוד חשוב.

Downstream promotor element  מכירים TAF6+9+inner sequencing  (שמזוהים על ידי TAF1+2).

יש כל מיני תת יחידות של TFIID (כמו שרואים בתמונה למעלה).

פקטור שעתוק קושר אינהנסר שעושה אינטרקציה עם    TFIIBשמגייס TBP לפרומוטור מסויים בתנאים מסוימים .

יש את 130TAFII+105 TAFII,3 TAFIIשהוא בעובר שהוא מתווך אינטרקציות בין פקטורי השעתוק לבין הפולימיראז .

יש שני פקטורים שדומים ל-TBP שקושרים משהו שונה מה-TATA BOX וכך יש הפעלה של פרומוטורים שונים .

לדוגמה:יש לנו ניסוי של  chip assayשעשו אותו על תאים שעשו להם סרקולציה של שלב S ,(לייצר היסטון) ,אנו רואים כאן probe שהשתמשו ב- PCR של היסטון 1,2,3,4 ובדקו מה TBP מעדיף לקשור ,TBP\TRF2 (TBP Related Factor) .היסטון 1 בגלל שהוא מיוחד הוא נקשר על ידי TRF2.

יש גם סוג אחר של TRF והוא TRF3 מאפשר להתמיינות תאי דם .

The mespa promoter was bound by Trf3, but not by TBP.

 

RNA polymerase II

(RNAPII). The enzyme that synthesizes mRNA in eukaryotic cells. RNAPII is composed of 12 protein subunits (RPB1–RPB12). The binding of RNAPII to promoters and the initiation of transcription requires many general transcription factors (TFs), for example, TFIIA, TFIIB, TFIID, TFIIE, TFIIF and TFIIH.

Core promoter

The region of a gene to which RNA polymerase II and the general transcription factors (TFs) bind to initiate transcription. Core promoters span from approximately 40 base pairs upstream to 40 base pairs downstream of the transcription start site and are composed of DNA elements to which subunits of TFIID (or TFIIB) bind.

Pre-initiation complex

The assembly of general transcription factors and RNA polymerase II on core promoter DNA. This complex, which can be assembled in the absence of nucleotide triphosphates in vitro, is competent to initiate transcription in the presence of nucleotides.

Transcription factor IID

(TFIID). A transcription factor for RNA polymerase II that binds core promoters. The TFIID complex is composed of the TATA-box-binding protein (TBP) and 13 or 14 TBP-associated factors (TAF).

TATA-box-binding protein

(TBP). The central subunit of transcription factor IID. TBP binds TATA boxes found in the core promoters of some eukaryotic mRNA genes.

TBP-associated factor

(TAF). All subunits of the transcription factor IID (TFIID) complex other than TATA-box-binding protein (TBP) are TAFs. There are 13 or 14 TAFs in the prototypical TFIID complex. There are also several proteins with sequence similarity to the prototypical TAFs, which are referred to as non-prototypical TAFs.

TBP-related factor

(TRF). A protein that is highly related in sequence to TATA-box-binding protein (TBP). Two TRF proteins are discussed in this Review: TRF2 (also known as TLF, TLP, TRP or TBPL1) and TRF3 (also known as TBPL2).

Xeroderma pigmentosum (XP):

·        Xeroderma pigmentosum (XP) is an autosomal recessive genetic disease.

·        The clinical syndrome includes marked sensitivity to sunlight (ultraviolet) with subsequent formation of multiple skin cancers and premature death.

·        The risk of developing skin cancer is increased 1000- to 2000-fold.

·        defect in repair of damaged DNA, particularly thymine dimers.

·        Cells cultured from patients with xeroderma pigmentosum exhibit low activity for the nucleotide excision-repair process. 

בדרך כלל אין מוטציות ב- General transcription factorאבל ב- TFIIHכן יש מוטציות שעלולות לגרום למחלות .

האם וירוסים מעכבים - General transcription factor?כן כי ה רוצים לעכב את ביטוי הגנים של התאים ,הסיגנלים התאיים –הוירוס כן מעכב אותם .

שיטת print shift :probe מסומן קושרים אליו חלבונים  ומריצים בגיל (יהיה הבדל במוביליות בגיל),וכמובן שיש לנו את הקונטרול.

וירוסים שהם רנ"א הם בדרך כלל נמצאים בציטופלזה אבל וירוס האינפולונזה שהוא וירוס של רנ"א הוא נמצא בגרעין ולא בציטופלזמה.

הירפס וירוס: יש להם גנום מאוד גדול .

 

 

יש 3 פאזות של ביטוי הגנים,אשר כאשר נכנס הוירוס לתא ואז יש את  ה immediate-early gene –יש פקטורי שעתוק של הוירוס עצמו ,ונכנסים לגרעין והם אחראים לביטוי של ה- early genes,כאשר יש רפלקציה של הוירוס ועכשו ה-) lagenceשהם חלבוני הקפסיד שאורזים את הוירוס)יכולים להתבטא שהם תלויים ברפלקציה של הוירוס.הקפסיד נבנה בגרעין וכאשר הוא יוצא מהגרעין הוא קורע את הממברנה של הגרעין ,ויוצא עם טיגומן וכמה חלבונים.

כאשר מכניסים תרופה לתאים שמעכב סינתזה של חלבון אז עדיין הרנ"א של החלבונים האלה immediate-early gene עולים,וזה אומר שהם לא תלויים באף חלבון .

ה-early gene הם תלויים בסינתזת חלבון של ה-  immediate-early geneצריכים חלבון אבל זה לא קשור לרפלקציה .

 

שיטת ה- footprint: שמים את החלבון עם הדנ"א ואז מוסיפים דנאז שמפרק דנ"א אבל הוא לא יכול לפרק איפה שיש קישור של החלבון לדנ"א ולכן כאשר אנו מריצים בגיל אנו רואים אזור ללא בנדים וזה יהיה אזור הקשירה.

כאשר TFIID קושר אז החלבון הויראלי עוזר לו לקישור ומייצב את הקומפלקס .

וירוס הפטטיס הוא מאוד קטן,אותו רצף במסגרת קריאה שונה נקודד לחלבון שונה.

Dominant negative :חלבון שיכול לקשור חלבון אחד ולא את השני והוא מעכב את החלבון התאי (WT).