שבר דו-גדילי בתא

 

זהו האיום הכי גדול על התא

קרינת גאמא וקרינת רנטגן הן מהגורמים המרכזיים לשבירה דו-גדילית. כמו כן, שבירה של גדיל אחד מובילה לאי-יציבות של הגדיל השני שיכול בהמשך להישבר גם הוא. תהליך מסוים במיוזה גורם באופן מכוון לשבירה דו-גדילית כדי לאפשר תיקון נזקים היוצר מוטציות, ובכך גורם לשונות באוכלוסיה.

 

תיקון שבר דו-גדילי

ישנן שתי מערכות לטיפול בבעיה זו:

1.     רה-קומבינציה הומולוגית - תיקון מדויק המתבסס על רצף הכרומוזום ההומולוגי לזיהוי הרצף שאבד.

2.     Non-Homologous End-Joining - אין גדיל משלים שניתן להשתמש בו בתור תבנית, ויש צורך לסנתז מחדש את החלק שאבד.

Non Homologous End-Joining

כאשר ישנה שבירה דו-גדילית, קודם כל יש לתפוס את החלק השבור של הכרומוזום (אחרת הוא ילך לאיבוד או יעבור טרנסלוקציה). אחר כך יש לעכל את הקצוות שעברו נזק (משום שלעיתים אין קצוות פוספאט, ואין אפשרות לחבר את החלקים יחד). לאחר מכן יש לחבר את השבר בחזרה.

מערכת זו אינה זקוקה לכרומוזום הומולוג והיא עצמאית (מה שמאפשר לה לעבוד בכל שלבי חיי התא, אך בעיקר בשלב G1), ולכן היא כנראה המערכת העיקרית לתיקון מצב זה. הבעיה במערכת היא שהיא אינה מדויקת (עיכול הקצוות גורם לאיבוד מידע גנטי).

בהמשך למערכת המזהה את השבר, חלבונים בשם Ku70 ו-Ku80 מתחברים לאזור השבר, יוצרים הטרו-דימר (דימר של שני חלבונים שונים בקומפלקס) ומגייסים מספר חלבונים נוספים: DNA-PKcs (גורם לזרחון מספר חלבונים אחרים הקשורים לתהליך) ו-Artemis המעכלים את הקצוות, ולבסוף Ligase-4 ו-Xrcc-4 מחברים את הקצוות וסוגרים את השבר.

מערכת זו אינה פועלה רק בשבר דו-גדילי מהסוג הזה, אלא גם ביצירת השונות בנוגדנים (תהליך הנקרא VDJ-Recombination): אזורים מסוימים נחתכים במכוון, ובגלל שהחיבור שלהם אינו מדויק מקבלים נוגדנים השונים אחד מהשני ופועלים טוב יותר במערכת החיסונית.

עכבר שמשתקים אצלו את מערכת זו מראה הופעה מוגברת של גידולים וטרנסלוקציות, ולא יוכל לייצר נוגדנים ("Scid"; המקבילה העכברית של ילדי הבועה, רק שמדובר בחלבונים אחרים..).

מכיוון שרוב הגנום באדם אינו מקודד לחלבונים, רוב איבוד המידע אינו קריטי, אך בהעברת מידע לדור הבא (מיוזה) נעשה שימוש במערכת אחרת.

 

Homologous Recombination

מערכת זו שכיחה בשלבים בהם יש שני הומולוגיים (המערכת השולטת במיוזה), והיא משתמשת בנוכחות רצף הומולוגי כדי לתקן את השבר הדו-גדילי.

בתחילה יש לעכל בעזרת חלבוני קומפלקס MRN את קצה ה-5-prime המשאיר קצה 3 חופשי. קצה חופשי זה מתעטף במספר חלבונים מגנים (Single Strand Binding Proteins) כדי למנוע עיכול על ידי אקסונוקלאזות. חלבונים נוספים בשם Rad51, Brca1 ו-Brca2 מחפשים את הרצף ההומולוגי בכרומטידה האחות, וגורמים לפלישה של קצה 3 זה לתוך הכרומטידה. במצב זה נוצרת דחיקה של הגדיל המשלים ללולאה ("d-loop'), ואז משלימים את הגדיל החסר בעזרת הדחיקה.

התוצאה היא שני כרומוזומים הומולוגיים שלא איבדו מידע גנטי.

 

מערכת זו תפעל בעיקר בשלבים S או M (פגישת הכרומטידה האחות), אך לעיתים תפעל גם ב-G1 (אז אין כרומטידה אחות, וגם מערכת זו תגרום לאיבוד מידע גנטי). יש השערות שככל שעולים בעץ האבולוציוני (שמרים ופטריות ß בני אדם) יחס חשיבות המערכות משתנה: בעוד שבשמרים ופטריות מערכת זו היא העיקרית, בבני אדם כנראה שהמערכת הקודמת חשובה יותר (נראה לי הפוך).

מדוע יש צורך במערכת זו במיוזה? משום שהפלישה המתרחשת במצב זה מחזקת את הקשרים בין הכרומטידות האחיות.

במידה ומעתיקים את המידע מהכרומוזום ההומולוגי, אנו מוסיפים לשונות באוכלוסיה.

בעצם יש עניין שיהיו כמה שיותר רה-קומבינציות הומולוגיות, ובאמת רואים שיש שבירה מכוונת כל בערך 25 אלף בסיסים: חלבון בשם Spo11 (המצוי משמרים ועד בני אדם) גורם לשבר דו-גדילי באופן מכוון. לאחר השבירה, הטיפול יהיה כמו שתיארנו. על סמך הפרדת הכרומטידות נקבל שינויים במידע הגנטי שיעבור מכרומטידה לכרומטידה.

מוטציות ב-Spo11 גורמות לכרומוזומים לא להידבק אחד לשני כמו שצריך, וגדל הסיכוי לאי-הפרדה תקינה ועקרות.

 

בעקבות התהליך במיוזה, יכול להיווצר מצב בו שני אללים שונים לאותו הגן יימצאו באותו מקום בשתי כרומטידות אחיות:

 

התא יודע לעיתים לתקן את אחד האללים כך שיתאים לאחיו. נקבל אחד משלושה מצבים כאשר החלוקה בתאים הסופיים תהיה לפי התיקון שבוצע:

1.     יחס של 4:4 - נדע שלא הייתה רה-קומבינציה או שהיא תוקנה למצב המקורי.

2.     יחס של 2:6 או 6:2 - הייתה רה-קומבינציה ויודעים לפי צורת האוקטראדה היכן תוקן האלל.

3.     יחס של 5:3 או 3:5 - הייתה רה-קומבינציה והיא לא תוקנה.

 

אירועי רה-קומבינציה מיוטית הם אירועים מכוונים, אך לא כ"כ אקראיים כמו שאנו חושבים. ישנם אזורים שנוטים יותר לעבור רה-קומבינציה (אזורים היפר-רה-קומביננטיים) ואזורים שנוטים לעבור פחות רה-קומבינציה (אזורים היפו-רה-קומביננטיים). ניתן לבדוק זאת בניסוי פשוט בו מפרידים כרומוזומים במהלך המיוזה ומריצים אותם על ג'ל. במידה והכרומוזום לא עבר שבירה, נקבל כרומוזום שלם. במידה הכרומוזום עבר שבירה, נקבל אינספור קטעים שונים של שברים. אם הכרומוזום עבר שבירה לא אקראית, נקבל גדלים מסוימים וגדלים משלימים להם בתדירות גבוהה שמציינים אזור שבירה קבוע.

בהתאם לכך, ניתן למפות את השברים הדו-גדיליים בכרומוזומים של מין מסוים, ולמצוא איזה רצף גורם לאופי היפר- או היפו-רה-קומביננטי. זוהי תכונה שנשמרת לאורך האבולוציה ואינה תלויה במין או בזן מסוים.

 

מערכת Mismatch Repair

 

המערכת בחיידקים

המערכת מזהה אי התאמה בין בסיסים של שני הגדילים. כאשר היא מזהה בעיה, היא מסירה את הבסיס הפגום ומסנתזת את החלק מחדש.

איך המערכת יודעת לפי איזה גדיל לתקן את הבעיה?

על הגדילים המקוריים ישנה מתילציה אשר עדיין אינה קיימת על הגדילים המועתקים. רק לאחר תיקון הבסיסים תתבצע מתילציה של גדילים אלה.

המערכת בבני אדם

כאשר ישנם חזרות רבות של נוקליאוטידים, יכולה להתבצע רה-קומבינציה במהלך ההכפלה היוצרת לולאה בגדיל. המערכת יודעת לזהות ולהסיר את הלולאה ולסנתז אותה מחדש בעזרת שני החלבונים hMutS-alpha ו-hMutL-alpha (מכונים MutS ו-MutL).

 

NER - Neucleotide Excision Repair

 

נתאר שתי מערכות דומות, בחיידקים, בשמרים ובבעלי חיים.

מנגנון המערכת בחיידקים

 

הגנים ב-NER נקראים בחיידקים uvr (שמם נקרא עקב קרינת UV).

המערכת מזהה שינויים במבנה המרחבי של ה-Helix כתוצאה מ-Mismatch (החלפה שגויה של הבסיסים) או כתוצאה מחשיפה ל-UV (הפיכת זוגות T-T, C-T או C-C לדימרים).

 

אופן הפעולה:

1.     uvrABC Excinuclease – מסיר 12 נוקלאוטידים.

2.     DNA Polymerase I – מסנתז את הקטע מחדש לפי הגדיל המשלים.

3.     DNA-Ligase – מחבר את המקטע המסונתז.

 

למרות שנראה כאילו מנגנון ה-Base Excision Repair הוא מנגנון דומה למנגנון NER, הם עובדים על בעיות שונות, עם אנזימים שונים ומסתנזים אורכים שונים של גנום (NER תמיד מסנתז 12 בסיסים בעוד של-BER יש מסלול ארוך ומסלול קצר).

נציין שכאשר יש שבר חד-גדילי, גם הגדיל השני נוטה להתפרק ואנו עלולים לאבד מקטעים של הכרומוזום.

 

מנגנון המערכת בשמרים

1.     TFIIH – פותח את הדו-גדיל באזור התקלה.

2.     Rad3 ו-Ssl2 – מגייסים את Endonuclease כדי לחתוך את הגדיל הפגום.

3.     DNA-Polymease – מסנתז את החלק שנחתך.

4.     DNA-Ligase – מחבר את המקטע המסונתז.

 

מנגנון המערכת בבעלי חיים

 

אנו מכירים שתי מערכות לתיקון DNA:

 

1.     Global Genome Nucleotide Excision Repair (GG-NER) - מערכת זו סורקת את הגנום כל הזמן. במידה ונמצאו אזורים השונים במבנה המרחבי של ההליקס, המערכת מגויסת לשם עם האנזימים שלה: אנדונוקלאזות (XPF, XPG), הליקאזות (XPB, XPD) ועוד. המערכת אינה תלויה באירועים בתא אלא עובדת באופן עצמאי.

 

1.     Transcription-Coupled Nucleotide Excision Repair (TCR-NER) - מצומדת לאנזימי Transcription (שעתוק). במידה ויש גן העובר שעתוק ויש שינוי במבנה המרחבי (עקב mismatch או דימרים של TT), יוכנס בסיס שגוי והחלבון הנוצר יכיל גם הוא מוטציות.

כאשר RNA-Polymerase נתקע עקב שינוי במבנה המרחבי, חלבוני CSA ו-CSB של המערכת נקשרים לאזור ומגייסים את אותם חלבונים של המערכת הגלובלית. מרגע זה מנגנון התיקון זהה למערכת הגלובלית. לאחר התיקון, RNA Polymerase נקשר שוב וממשיך.

ההבדלים העיקריים בין מערכות בחיידקים למערכות בבעלי חיים: מערכות שהן Error Prone (הכוונה למערכות תיקון פחות מדויקות) יותר שכיחות בחיידקים

מוטציות במערכת TCR-NER

מוטציות ב-CSA או CSB גורמות לבעיות בקרנית העין, בעיות שמיעה, רגישות לאור ומוות מוקדם.

 מוטציות ב-XPD (אחת משתי הליקאזות שפותחות את ה-DNA ב-GG-NER) מובילות לרגישות לאור, שיער שביר, פצעים ומבנה עור לא תקין עקב נזקי UV ותוחלת חיים קצרה.

עכברי knock-out לחלבון זה מראים אובדן שומן, אוסטאופרוזיס, סימפטומים דומים לאלה שתיארנו באדם ופשוט נראה זקן (עכבר D).

Base Excision Repair – BER

 תהליך EMS - אתילציה לבסיס. תהליך MMS - מתילציה לבסיס.

מערכת זו יכולה לתקן בסיסים שעברו התמרה. בתחילה המערכת מסירה את הבסיס ומשאירה שלד סוכרי. מערכת נוספת יוצרת שבר חד-גדילי, מחליפה את הבסיס ו-DNA-Ligase מתקן את השבר.

מנגנון פעולה

AP - A-pourinic site או A-pyrimidinic site. מצב בו חסר בסיס אחד.

המערכת צריכה להתמודד עם המצב:

1.     Glycosylase – חותך את הבסיס ומשאיר אתר AP.

2.     Endonuclease – מגיע ל-AP וחותך בתוכו (Endo – חותך מאמצע הגדיל), כך שנשאר שבר חד-גדילי.

3.     Exonuclease – מגיע לקצה השבר ומתחיל לעכל משם (Exo – מבצע חיתוך מקצה פתוח של DNA). אורך העיכול – עד 12 בסיסים.

4.     Pol-beta – מסנתז מחדש את מקטע ה-DNA.

5.     DNA-Ligase – סוגר את השבר החד-גדילי.

 

ישנם שני מסלולים מאוד קרובים בתיקון זה - הסרה של מקטעים קצרים והסרה של מקטעים ארוכים (לא נפרט על ההבדלים).

חשיבות מנגנון זה היא עצומה - במידה ומסירים מעכברים את החלבון Pol-beta העכברים ימותו בתור עוברים.

Photolyase – פוטוליאז

 

שני בסיסי T הנחשפים לקרינה UV יכולים ליצור דימר. האנזים Photolyase יודע לנתק את דימרים אלה בחזרה לשני בסיסים מופרדים.

מערכות תיקון מדוייקות

 

נתייחס ל-3 צורות תיקון:

 

1.     Direct Reversal - לקחת את הבסיס הפגום ולהחזיר אותו למה שהוא היה.

2.     Base Excision - להוציא את הבסיס הפגום ולהכניס אחד אחר במקומו.

3.     Segment Removal and Replacement - חיתוך האזור כולו וסינתוזו מחדש. הרעיון בגישה זו הוא שכנראה שגם סביבת הבסיס הפגום נחשפה למוטגן, ועל כן תיקון הסביבה כולה יהיה התיקון הטוב ביותר.

מערכת ה-SOS בחיידקים (Error Prone)

 

אלה מערכות בעלות יעילות תיקון גרועה, אך הן יכולות להציל את המצב במקרים קיצוניים.

במקום הבסיס הפגום המערכת מכניסה בסיס אקראי כלשהו.

במקרה של עקה גדולה, המערכת תגרום לחיידק למוטציות רבות ובכך בעצם לשונות באוכלוסיה ולהתמודדות עם מצב העקה (לדוגמה: המוטציות הגורמות לחיידקים לעמידות לאנטיביוטיקה).

נמצא במערכת זו חלבונים כגון DinB, UmuC, ו-UmuD האחראים על התיקון (לא צריך לזכור).

גם בתאים אאוקריוטים ניתן לפגוש מערכות דומות.

 

בציור אנו רואים הכפלה של ה-DNA ושני חלבונים מסוג Pol.

שני חלבונים אלה מאפשרים להעתקה לעבור את הבסיס הפגום תוך תיקון על ידי בסיס אקראי.

הקשר בין האבולוציה למוטציות בגנים

 

ההיסטוריה שלנו זה ענין של אבולוציה במשך כל השנים. מאמר זה עוסק בקשר בין אבולוציה לבין מוצטציות בגנים. משווים רצפים של אותיות בדנ"א, ובודקים את הרצף בגן המקודד לחלבון מסוים (למשל המוגלובין) בין מינים שונים, למשל עכברים שימפנזים ובנ"א ורואים מה ההבדלים.

רואים שבמינים שונים לפעמים יש שינוי באות אחת בדנ"א.

בגלל שזה חלבון שיש לו פונקציה דומה ותפקוד אולי קצת אחר באורגניזם אחר, צפוי שהוא גם יראה אחרת באותיות הדנ"א.

80 אחוז מהאותיות בגנים זהים במינים שונים, והשאר שונה. אבל גם אחוז השונה משתנה בין המינים.

צריך לבחור את מקטע הדנ"א, שיש שוני אבל לא גדול מדי במינים שבודקים.

 

למשל אם אנחנו בודקים מה ההבדל ביננו לבין השימפנזים צריך לחפש שינוי בדנ"א שהוא גדול, אבל לא מידי.

יש קטעים שמקדדים חלבון, ויש קטעים שלא מקדדים לחלבונים. ההבדל הוא גדול יותר בקטעים שלא מקודדים לחלבונים.

בקטעים שמקודדים לחלבונים ההבדל הוא קטן יותר כי לחלבון יש  תפקיד מאוד דומה כמו לשאר החיות בכדור הארץ, וכך שאם חלבון צריך לעשות משהו, זה צריך לעשות משהו דומה בעכבר ובאנשים, לכן יהיה שינוי, אבל  הוא לא יהיה גדול מדי.

 

אם מסתכלים על הרצף של האותיות שמקדדות לחלבון , צפויים להראות שינויים מאוד איטיים באבולוציה, כי אם פוגעים ביצירה של חלבון בריבוזומים (הריבוזומים הוא אברונים בתא שבהם מתרחשת הסינתזה של חלבונים.)  זה יכול להיות קטלני. 

 

צריך לקחת שני מינים מודרנים, למשל אנחנו ואורנג אוטנג, וצריך לקבוע לפי המאובנים מתי נפרדנו.

זה לא נקבע לפי הדנ"א, אלא לפי התפרקות של יסוד רדיואקטיבי ולפי טיעונים גאולוגים.

 

או שקובעים רצף של אותיות בגן, ומשווים אותו בין שני המינים, למשל בקוף ובבני אדם. ואז אנחנו יודעים ששני הגנים עברו אבולוציה מסוימת, ושני הגנים, אנחנו יודעים את הזמן לפי המאובנים מתי הם נפרדו. ורואים בדנ"א את השינוי באותיות וכאשר מחלקים את זה לפי ציר הזמן, יודעים כמה שינוי יש לכמה זמן.

 

דנ"א מיטוכונדריאלי

יש טענה שקצב האבולוציה הוא קבוע.

למיטוכונדריה יש דנ"א  משלו, ומקבלים אותו מהאמא. בדנ"א המיטוכונדריאלי יש מספר  הוא גם מקדד את הריבוזומים בר.נ.א.

קצב המוטציות גבוה יחסית במיטוכונדריה, שזה נח לחישובים כאלה.

 

השינויים בדי אן אי של המיטוכונדריה בבני אנוש משקף את ההיסטוריה של הנקבות אצלנו ולא של הגברים.

שימוש מעניין בדי אן אי של המיטוכונדריה זה לדעת למשל מאיפה יהודים באו. אז בודקים את הדי אן אי של המיטוכונדריה של נשים יהודיות ומשווים, והגנים האלה דומים לכל מי שחי באזור הים התיכון, גם יהודים שהגיעו ממקומות אחרים בעולם.

החוקרים בדקו שינויים באותיות שמשנות משהו, לבין מה שלא משנה בכלל. יש הרבה שינויים בין בני אנוש לשימפנזים בערך 70 שינויים, לבין שינויים בין בני אדם במקומות שונים. השימפנזה שונה מאיתנו כמו שהוא שונה מגורילה. וכך גם ניתן להגיד שהוא הכי קרוב אלינו. קצב השינוי הוא די לינארי כלומר הוא היה די קבוע.

תהליך המיוזה ביצור טריפלואידי ופוליפלואידיות בחיטה

 

תהליך המיוזה ביצור טריפלואידי

יכולים להיווצר שני מצבים לפני החלוקה הראשונה:

 

1.     Trivalent - שלושת הכרומוזומים יוצרים הומולוגיה ביניהם באזורים שונים (שניים בצנטרומר, והשלישי מתחבר אליהם באזור אחר).

2.      Bivalent ו-Univalent - שני כרומוזומים יוצרים הומולוגיה באזור הצנטרומר (Bivalent), והכרומוזום השלישי נשאר לבד (Univalent).

 

פוליפלואידיות בחיטה

החיטה כפי שאנו מכירים אותה כיום בנויה מסט של 6n עקב הכלאות של זנים קרובים. מכיוון שהיא מכילה כל כך הרבה כרומוזומים, היא יכולה לשרוד גם במידה וכרומוזום אחד חסר.

יצירת צמחים עמידים

 

Colchicine - חומר הפוגע במיקרוטובולים של התאים. חשיפת תאים לקולכיצין מאפשרת למנוע את חלוקת הכרומוזומים לתאי הבת, ובכך ניתן ליצור תאים פוליפלואידיים.

 

מגדלים צמחים באופן מונופלואידי בצלחת הכוללת רעל. לצמחים ששורדים נותנים לנבוט ולגדול.

הצמח שנוצר הוא עמיד לחומר, אך הוא עקר מכיוון שהוא כולל רק עותק אחד של כל כרומוזום.

בשלב זה חושפים את התאים לקולכיצין והופכים את הצמח לדיפלואידי. מקבלים צמח המסוגל להרבות העמיד לרעל.

 

יצירת צמח מונופלואידי

 

חושפים את הנבטים לשוק של קור, ובתגובה הם גדלים כמונופלואידיים.

ניתן להשתמש בתהליך זה כדי לבדוק את הפנוטיפ של גנים - אז כל גנוטיפ מתבטא באופן מוחלט.

בנוסף, צמחים כאלה הם עקרים, וניתן למכור אותם כדי לוודא שהקונה יצטרך לקנות שוב לאחר סוף העונה.

אללים בצמחים - הגדרות למספר הכרומוזומים בתאים

 

1.     Polyploids  פוליפלואידיות - פרט בעל יותר משני עותקים מכל כרומוזום (n>2). קיים בעיקר בצמחים ובתאים סרטניים (שם הבקרה כמעט ולא קיימת).

 

a.     Autoployploid אוטופלואידיות- כאשר ההעתקים הנוספים של הפרט הפוליפלואידי הגיעו מפרט מאותו המין.

 

b.      Allopolyploidsאלופלואידיות - כאשר ההעתקים הנוספים הגיעו מפרט ממין שונה (לדוגמה: כרוב וצנון, שני זנים של חיטה וכו').

2.     Monoploids מונופלואידיות- פרט בעל העתק אחד מכל כרומוזום (n=1). נשים לב שזהו מצב לא תקין של הפרט, ולא פרט שהוא האפלואידי.

 

3.     Homeologous  הומולוגים - כאשר שני הכרומוזומים בפרט דיפלואיד דומים אך לא הומולוגיים לגמרי, ואז יש בעיה ב-Pairing שלהם במהלך המיוזה. ברוב המקרים מקור שני הכרומוזומים הוא מאותו אב-קדמון.

 

4.     Aneuploidy אנפלואידים - שם כללי לשינוי מספר הכרומוזומים. צמחים הם הרבה יותר סבלניים לשינוי מספר הכרומוזומים. הפנוטיפ הוא לרוב שינוי גודל הצמח - ככל שיש יותר כרומוזומים כך הצמח גדל לגודל מרשים יותר. מספר דוגמאות:

a.     Monososmic – כאשר ישנו העתק אחד פחות של אחד מהכרומוזומים בתא. בהאפלואיד דיזומי מספר הכרומוזומים הוא 2n-1.

 

b.     Nullisomic  - מצב שבו יש חוסר של סוג כרומוזומים. בהאפלואיד דיזומי מספר הכרומוזומים הוא n-22.

 

c.     Disomic – כאשר ישנו העתק נוסף של אחד מהכרומוזומים בתא. בהאפלואיד דיזומי מספר הכרומוזומים הוא 2n+1.