ביולוגיה התפתחותית - שיעור 4

 קצת חזרה על שיעור קודם, ישנם שני תהליכים דרמטיים בתהליך ההתפתחותי, אחד נקרא first cell fate decision  והשני second cell fate decision , היום נדבר על המנגנון המולקולרי של שני התהליכים הללו. ב- first cell fate decision אנחנו מבחינים ב- outer  ו–inner cell ואילו ב- second cell fate decision אנחנו מבחנים ב- ICM בשני סוגי תאים PE ו EPI- . אנחנו מתחיל בבלסטוציט עם ICM עם תאים שאינם הומוגניים  וחלק מתהאים האלה יהפכו תהליך דיפרנציאלי להיות PE (מאבד את הפלוריפוטנטיות , לא נותן רקמות עובריות) והחלק השני יהפוך ל- EPI שומרים על פלוריפוטנטיות . 

בשפעם הקודמת דיברו על 4 פקטורי שעתוק, פעם קודמת התייחסנו אליהם כמרקרים, ישנה קורולציה בין איך הם מתבטאים. הפעם נדבר על הפונקציה שלהם. פקטור שעתוק ברמת החלבון נמצא בגרעין בניגוד לרנ"א שאינו נמצא בגרעין אלא נמצא בציטופלזמה. 

Oct4 בשלב המורולה מתבטא באופן הומוגני בכל התאים ולכן בצביעה היינו רואים את כל התאים הפנימיים והחיצוניים צבועים. בשלב מסויים (Mid) רואים ירידה ברגולציה בטרופואקטודרם ועלייה ברגולציה ב-ICM ובשלב מאוחר יותר היינו רואים ביטוי שלו רק ב- ICM.                        

        Nanog מתבטא Salt & pepper expression  בשלב המורולה ישנם תאים שמבטאים אותו וישנם תאים שלא, בשלב הבלסטוציסט יש ירידה ברגולציה בתאי הטרופואקטודרם אבל לא ב- ICM גם ב- ICM יש Salt & pepper expression. Gata4  מתבטא בעיקר ב- PE (כאשר רואים את gata4  זה לא אומר שהתאים האלה הם PE זה רק אומר שהם מיועדים להיות)  תאים שמבטאים את nanog לא מבטאים את gata4 ולהפך.

 

Oct4 loss of function :  

רואים תאים בשלב המורולה, אין חלל, כל התאים עברו צביעה לoct4 רואים שכל התאים  WT מבטאים oct4 לעומת זאת במוטנטים רואים שאין ביטוי של oct4 אבל הם מורולות לכל דבר, הם נראים נורמאליים לחלוטין. בתמונה של הבלסטוציסטים רואים שה- wt נצבע יפה ב- inner cell , בהטרוזיגוט רואים ירידה בצביעה, לעומת זאת במוטנטים נוצר חלל הבלסטוצל ויש שם משהו שנראה כמו ICM כלומר העובר מתפתח באופן נורמאליים אבל הם קטנים יותר. בתמונה שמאלית התחתונה ישנה צביעה גרעינית שבה משווים בין שני עוברים רגיל ומוטנטי ומסתכלים מה ההבדל בניהם, המוטנטי קטן יותק אבל יש בו ICM, אם סופרים את התאים החיצוניים בשני העובריים התוצאה היא זהה, אותו דבר גם בתאים הפנימיים. אבל העובריים המוטנטיים עדיין קטנים יותר לכן ניתן להניח שמשהו לא תקין, לכן נלך שלב התפתחותי קדימה של ההשרשה בבטן - Peri-implantation  , רואים פה הבדל יותר דרמטי ועכשיו נעשה assay in vitro. הניסוי הראשון הוא שלקחו שני עוברים ושמו אותם בתרבית רקמה (צריך לדאוג שהעובר יצמד גורם לתהליכים שלא קורים in vivo) ניתן לראות כי תוך 24 שעות ב-wt כל הטרופואקטודרם נפרס על הפלטה ותהאים הגדולים זה תאי הטרופואקטודרם והגוש שנשאר זה ה- ICM  (ככה נראית מושבה של ESC). במוטנט לעומת זאת התאים מתרפים (?) נוצר טרופואקטודרם אבל אין שום דבר שמזכיר ICM , אבל בשלב קודם ראינו משהו שנראה כמו ICM , כלומר זה לא ש- ICM לא נוצר, הוא נוצר אבל הוא לא מתוחזק הוא הופך למשהו אחר . אחרי 4 ימים לקחו את שני העוברים אבל לפני ששמו אותו בתרבית קילפו את התרבית החיצוני, כלומר לקחו רק את התרבית הפנימית ואותה שמו על תרבית. ב-wt  רואים את ה-icm אבל רואים גם תאים מסביב שנודדים והתאים האלה הם parietal endoderm המקור שלהם הוא PE . לעומת זאת התאים של העובר המוטנטי גם כן משתטחים אבל הם נראים כמו טרופובלבטים זאת אומרת שהתאים הפנימיים מקבלים fate של טרופואקטודרם , הם לא נשמרים כ- ICM הם מאבדים את הפלוריפוטנטיות שלהם. התאים הפנימיים קיבלו אדפטציה אחרת, קיבלו תכונות של טרופובלסטים.

עד עכשיו ראינו ניסוי בתרבית רקמה עכשיו נראה ניסוי in vivo, בניסוי עכשיו אנחנו משתמשים בנוגדן שמכיר את Troma 1 זהו קרטין מסויים שמתבטא אך ורק בטרופואקטודרם ICM לא מבטאים אותו. יש שני עוברים אחד מוטנט והשני WT. לקחו את שניהם וצבעו עם נוגדן נגד Troma 1, זה עובר שלם ולכן רואים את המעטפת ולכן בשניהם נראה צביעה  נגד Trona 1  כי לשניהם יש במעטפת תאים שאמורים להיות טרופואקטודרם. עכשיו עשו את הניסוי הבא, כמו מקודם קילפו את התאים החיצוניים ולקחו רק את התאים שבפנים, רואים בתמונה כי ה- WT לא נצבע ואילו המוטנטי נצבע. מבחינת אדפטציה התאים הפנימיים לוקחים fate  שונה, לוקחים fate  של טרופואקטודרם כאשר עושים LOF  ל- oct4.

 

Nanog loss of function :

רואים מצב של אחרי ההשרשה ברחם Post-implantation  בצד שמאל אנחנו רואים עובר נורמאלי ואילו במוטנטי אנו לא רואים עובר נורמאלי, נוצר משהו אבל אנו לא רואים עובר. אם אנחנו מסתכלים על הבסלטוציט  (C)הוא נראה נורמאלי יש טרופו' יש ICM  כמו במקרה הקודם, אבל כאשר עושים in vitro על תרבית תאים שמים לב שב-WT הטרופובלסטים משתטחים, מקבלים תאים גדולים ויפים, באמצע רואים את ה- ICM  בצורה יפה, עש הנקודה הזו הפנוטיפים של oct4  ו- nanog מאוד דומים. זה אומר ששניהם משתתפים כנראה באותו תהליך. יש להבחין בין שני מושגים: redundancy   ו- overlapping. כאשר יש שני גנים שעושים בדיוק את אותו דבר (באותם תאים והכל בדיוק אותו דבר) אז אם עושים LOF  לאחד מהם לא נקבל פנוטיפ אלא אם כן נעשה LOF לשניהם, זה redundancy. זה מושג מלאכותי כי אבולוציונית זה לא יכול להיות. אבל כשיש שני גנים שונים שכשעושים מוטציה מקבלים פנוטיפ וכשעושים מוטציה לשני מקבלים את אותו פנוטיפ זה אומר ששניהם משתתפים באותו תהליך וזה לא redundancy. שני הגנים האלה משתתפים באותו תהליך אבל זה לא אומר שהם עושים את אותו דבר!!!!!!!

עכשיו אנו רואים ויראציה שזה לא בדיוק אותו פנוטיפ, בניסוי אחר לקחו עובר קילפו את המעטפת החיצונית ולקחו רק את התאים הפנימיים, רואים ב-WT  את parietal endoderm המקור שלהם הוא PE ובמוטנט לא רואים טרופובלסטים, רואים תאים שנראים כמו parietal endoderm, זאת אומרת שב- nanog mutant נוצרים ICM אבל הוא לא מצליח להיות מתוחזק והוא הופך ל- PE  . על מנת לבדוק זאת משתמשים במרקרים של כל מיני תאים שהמקור שלהם הוא PE. כלומר קיבלו ICM אבל הוא לא מצליח לשמור על פלוריפוטנטיות שלו והוא הופך להיות PE.

המודל מראה שלב של מורולה ששם אנו מבחינים בין inner ל-  outer cell. ה- inner cell צריכים להיות ה- ICM ומי שמאפשר להם להיות ICM זה oct4. בנוסך אנו יודעים גם שה-oct4   מונע מהתאים הללו להפוך להיות טרופואקטודרם, זה מצב של למנוע מתאי ה-ICM להפוך לטרופואקטודרם. ה- nanog עובד down stream כי רואים ש nanog מקדם את הפיכת ה-ICM לepi  ומונע יצירה של PE. אם מורידים את nanog ייווצר PE ולא יישאר EPI.

Totypotency vs. Pluripotency : הגנים האלה נקראים גם Pluripotency maitaining genes . יש שני דרכים להסתכל על פלוריפוטנטיות וטוטיפוטנטיות. דרך אחת זה לחשוב ששניהם זה שתי חיות שונות כלומר אין קשר שניהםץ דרך שנייה להסתכל על זה היא להגיד שטוטיפוטנטיות זה טוטיפוטנטיות ועוד כמה דברים a b c d.. כלומר יש ליבה מסויימת שהיא הפלוריפוטנטיות ואם רוצים להפוך את זה לטוטיפוטנטיות צריך להוסיף דברים.  Totipotency=Pluripotency+a+b+c+… .       ICM Pluripotency=Pluripotency+b+c+… . Epi Pluripotency=Pluripotency+c+… . הבסיס זה הפלוריפוטנטיות. הגנים שומריםי על הליבה הזו, על הפלוריפוטנטיות! ולכן הם נקראים כך! (oct4  ו-nanog)

Gata4/6 :

גם הוא פקטור שעתוק. פקטור זה מתבטא בתאים שהולכים להיות PE. אם עושים LOF של gata4 העוברים שנוצרים לא מכילים PE. היעד שלו הוא ב-second fate decition . המצגת רואים היכן gata4  ממוקדם המודל. התפקיד שלו להפוך ICM ל-PE זה בהחלט לא Pluripotency gene.       האם המודל בשקופית 7 מדויק??  למודל יש קשר למציאות אבל לא בהכרח קשר של אחד על אחד, לאט לאט מתקנים עד שנקבל מודל נכון יותר. 

עכשיו נחזור ל- Nanog loss of function  (כל מה שיודעים על nanog מגיע מ- in vitro).עכשיו שואלים אם זה נכון in vivo- בתמונה רואים עובר שפעם נצבע נגד gata4 ופעם נצבע נגד oct4, זה אותו עובר. שמים לב שהעובר הנורמלי מכיל תאים שהם gata+ הם הולכים להיות ה-PE.oct4  מתבטא בשני סוגי התאים הם עדיין לא PE, הוא שומר על הפלוריפוטנטיות. אבל בעוברים המוטנטים אין gata4+, הם אמנם נראים נורמאליים nanog  נראה נורמאלי. בשלב התפתחותי הבא אנחנו מסיקים משהו שונה לגמרי, אנחנו רואים שפה nanog  מאפשר יצירה של PE. יש פה סתירה, מצד אחד אנחנו אומרים שהוא   מאפשר /מעכב יצירה של PE.

בתמונה הזו אנו מתחילים עם עובר תאים לבנים (Nanog) ותאים אדומים (Gata4 ) ורואים שתאים שמבטאים Nanog אינם מבטאים Gata4 ולהיפך.  ככל שמתקדמים בהתפתחות אנו מקבלים הפרדה בין תאים שמבטאים Nanog לבין תאים שמבטאים Gata4. התאים זזים ומסתדרים כל אלה שהם gata4 נעים לאזור החלל  והם אלה שיהפכו ל- PE.כאשר מסתכלים על הפרומוטרים של gata4  רואים שnanog כפקטור שעתוק יודע להיקשר  לפרומוטורים של gata4 .תא שמבטא nanog לא מבטא gata4!!! זה אומר שnanog- הוא רפרסור של gata4.  התא שמבטא nanog  יש לו רק יעד אחד וזה epiblast הוא לא יכול להיות PE.

Cell autonomous -פקטור מסויים מופרש ומשפיע אך ורק על התא עצמו שמייצר אותו ולא על התא השכן

-Cell non-autonomous מצב שבו הפקטור המופרש מתא אחד משפיע על התא השכן.

המשמעות היא שהתא הלבן שמבטא את nanog  דואג לכך ש gata4 לא יתבטא בו, אבל הוא דואג לכך שיהיה ביטוי של גן אחר שבכלל עובר הפרשה ומשפיע על התא השכן שאיננו מבטא את nanog. ולכן אם מסתכלים על המודל הוא אפשרי, nanog עושה אינהיביציה מתאים שהם ICM ל-PE באופן שהוא Cell autonomous ולעומת זאת nanog  באופן שהוא  Cell non-autonomousמשפיע על תאים שכנים להיות PE.

יש פה משחק בין nanog ל- gata4 על מנת ליצור את הייעוד בין EPI ו-PE. עד עכשיו דיברנו על second fate cell decition.

:Cdx2 loss of function

עכשיו נדבר על first cell fate decition.רואים עובר WT בשלב המורולה ומאפשרים לו in vitro להמשיך להתפתח. העובר השני הוא מוטנטי, נוצר בלסטוצל ואז יש "התמוטטות" אין יותר בלסטוצל. אם מסתכלים על המעטפת החיצונית של העובר המוטנטי התאים לא נראים אפיתלייאלים לעומת ה-WT.

בצביעה ניתן לראות שהפקטור שצבוע באדום הוא פקטור שמשתתף ב- tight junctions, E-cadherin משתתף ב- Adherens Junctions בEB לא רואים הבדל גדול אבל ב- LB רואים שה- WT נראה טוב אבל במוטנט התאים מבחוץ לא מראים מראה אפיתלאילי.

 

Red    = Oct4

Blue   = Integrin a7 (ספציפי לטופובלסטים)

Green= Nuclei stain .

במוטנט אין בלסטוצל, קיים בהתחלה אבל מיד נעלם. הבלסטוצל נעלם כיוון שתאי הטרופובלסט יוצרים שכבה הרמטית וסגורה שכל מיני חומרים לא יכולים לעבור בה, אבל אם מופרשים כל מיני חומרים אין להם דרך לצאת החוצה וכך נוצר החלל, אבל אם פוגעים בטרופובלסטים אנו פוגעים במחסום הזה וחומרים יצאו וכך יעלם לנו הבלסטוצל. בצביעה מבחינים בכמה דברים ב- WT      הבחנה ברורה בין התאים, לעומת זאת במוטנט כל התאים מבטאים oct4 גם התאים החיצוניים. מקבלים שהתאים היעוד שלהם אמורים להיות טרופובלסטים הם נשארים עם הפלוריפוטנטיות והם עם תכונות של ICM.

 

לוקחים עובר מוטנטי ועובר רגיל ואחרי כמה זמן רואים שהטרופובלסטים יוצרים מסטח יפה של תאים גדולים וה- ICM יושב יפה על הטרופובלסטים. במוטנט התאים מבחוץ אינם נשכבים ונראים כמו טרופובלסטים אלא הם שומרים על התכונות של ICM.

 

זה ה in situ, רואים מעקב אחרי  RNA, רואים מה קורה בציטופלזמה. ההיברידיזציה היא ל- oct4 ול-

cdx2. ב- WT לא נראה אותו בגרעין כי אנחנו עוקבים אחרי mRNA , המוטנט רואים oct4 בכל התאים, לא רואים cdx2  כי זה מוטנט לזה. ב- nanog  גם כן רואים במוטנט שכל התאים מבטאים את אותו. שני הפקטורים הללו הם Pluripotency gene הם אלה ששמורים על ה-ICM  והרגולציה שלהם עולה כאשר אין cdx2.

המסקנה היא ש cdx2 נחוץ על מנת ליצור טרופואקטודרם. (nanog מתחיל להתבטא כבר בשלב המורולה. גם nanog  וגם oct4 נמצאים שם מהתחלה רק שהביטוי של כל אחד מהם הוא בזמן אחר).

נדבר על השלב לפני ה- first cell fate decition  בשלב שבו יש מעבר משמונה תאים בודדים ל- compaction של התאים, ישנה polarization של התאים, כלומר לתא יש שני צדדים, צד אפיקלי וצד בזולטרלי. כל שמונת התאים אחרי תהליך ה- compaction הפכו להיות פולריים. כל התאים הם פחות או יותר אותו דבר אין שום fate decition.

ישנם חלבונים שמרוכזים יותר בצד האפיקלי ולא בצד הבאזולטרלי, כמו למשל par3, באסוציאציה עם הממברנה. ובאותה מידה ישנם חלבונים שנמצאים באזולטרלי כמו par1.ישנם גם E-cadhein שממש גורמים לממברנות להיות צמודות וזה מה שגורם ל- compaction וזה נועד על מנת ליצור הפרדה בין שני הצדדים. ההפרדה היא דרמטית!!!!!!!!!!!!!!!!!

First cell fate decition. רואים שתאים שהם inner הם אפולריים, הפולריות היא רק בתאים שהם outer. זה לא רק הבדל גאוגרפי, זה שינוי מהותי!! מה הקשר בין פולריות למיקום? האם יש קשר? 

נענה על השאלה כמובן! ע"י ניסוי Reciprocal  positional change: לוקחים תא שנמצא במעטפת ובאופן פיזי דוחף אותו פנימה לתוך ה-inner , התא הזה מפסיק להיות פולרי הופך להיות א פולרי והוא יהפוך להיות inner cell nass נעשה את הניסוי ההפוך. ניקח תא שנמצא בפנים ונדחוף אותו החוצה, הא הזה יהפוך להיות פולרי. הניסוי הזה מאשש היפותזה שנקראת ‘Inside-Outside’ hypothesis. ההיפותזה הזו אומרת שמי שמכתיב את ה"גורל" זה הסביבה. התאים מרגישים את הסביבה והסביבה משפיעה על ה- fate. 

ניסוי נוסף: (מה הקשר בין פולריות למיקום גאוגרפי של התא) Downregulation of Par3 and aPKC in one cell. לוקחים תא אחד ולעשות downregulation לשני חלבונים שנמצאים בתא האפיקלי. התא שעשיתי לו את זה יעזוב את ה- outer ויכנס פנימה להיות inner. זאת אומרת שהפולריות משפיעה על המיקום. הסביבה תשפיע על הפולריות והפולריות תשפיע על המיקום. וזה מביא אותנו לההיפותזה Polarization’ Hypothesis הפולריות תכתיב לאן התא ילך ICM או טרופואקטודרם. שתי ההיפותזות עובדות ביחד. 

איך יוצרים מצב שתאים מסויימים יהיו בפנים ותאים אחרים יהיו בחוץ?? הדרך היחידה לעשות את זה הוא מישור החלוקה, יש שתי אפשרויות: אפשרות אחת- חלוקה כזו שבה שתי תאי הבת יהיו זהים! והיא נקראת Symmetric Division , מקבלים לדוגמא שני תאים פולריים ולכן שניהם יהיו בחוץ. ישנה אפשרות שנייה- Asymmetric Division   חלוקה כזו שבה יוצרים שתי תאי בת שהם שונים אחד מהשני ככה שאחד מהם מאבד את הפולריות  כיוון שהפולריות מוכתבת ע"י הצד האפיקלי, מקבלים תא מעטפת ותא פנימי. ע"י שיטת החלוקה ניתן לקבוע איזה תא יהיה. ההחלטה של איזה חלוקה תתרחש היא חלק מה- first cell fate  

איך יוצרים פולריות? איך שולטים על מישור החלוקה? מה הקשר בין cdx2 לפולריות? מתברר שאם מעלים את רמות cdx2 אנו מעלים את הפולריזציה של התא  (מפתיע!!!!!!) ולהפך. אם נעשה את זה לתא החיצוני הוא יכנס פנימה. Cdx2 מסגול לשלוט על הפולריזציה של התאים. mRNA  של cdx2 מרוכז יותר בצד האפיקלי זה נקרא Asymmetric localization , החלבון שנוצר אין לו שום קשר לריכוז הזה,הוא נכנס לגרעין. Cdx2 מסודר בתא בצורה אסימטרית. הסידור הזה הוא תלוי פולריות Polarity

dependent , אם נעשה downregulation ל-par3 ה-mRNA יתפזר באופן הומוגני בתוך התא. שעושים חלוקה אסימטרית מקבלים שני תאים שונים כאשר בתא אחד נקבל רמות גבוהות של cdx2 ובתא השני רמות נמוכות. יש פה תהליך של Positive feedback loop between cell polarity and Cdx2 נועד לשני דברים עיקריים , הבטחה של דיכוטומיה הדבר השני הוא שיהיה לנו טרופואקטודרם, זה התפקיד של cdx2. 

רואים את שמונת התאים ורואים את ה- mRNA של cdx2 יושב בצד האפיקלי ועכשיו מתרחשת חלוקה סימטרית ומתקבלים שני תאים ירוקים שנשארים במעטפת. ועכשיו מתרחשת חלוקה אסימטרית, בתא אחד ישנם mRNA ובשני אין תא אחד הופך פולרי והשני לא, מקבלים עכשיו תאים פנימיים וחיצוניים. יש לשים לב יש הבדל מהותי בין mRNA lacalizaion לבין פקטור שעתוק. אמנם אין עכשיו mRNA בתא הפנימי אבל אין שום מניעה שהוא יתחיל לייצר אותו ולכן יש צורך במנגנון נוסף שיבטיח שהתא הזה ימשיך לא לייצר mRNA ויישאר בפנים. לכן המערכת חייבת להרגיש מה קורה בחוץ והיא עושה זאת באמצעות Hippo signaling cascade  הוא מסוגל לעשות downregulation של שעתוק של cdx2. הקסקדה הזו עובדת ככה: ישנם שני מצבים: מצב אחד של low cell density  במצב הזה החלבונים הממברנליים כמעט לא עוברים אינטראקציה ולכן יווצרו שני חלבונים YAP ו-TAZ. שניהם נקשרים לכל מיני פקטורי שעתוק בגרעין ומאקטבים אותם. במצב של high cell density הסביבה צפופה והחלבונים האלה נקשרים ויש סיגנל שמוריד את האפיניות של שני החלבונים YAP ו- TAZ, ואז חלבוני השעתוק הופכים ללא אפינים. אחד מהם נקרא TP הוא זה שמאפשר ביטוי של cdx2. אז כשיש חיבור של תאים המערכת מופעלת וכשאין המערכת לא מופעלת- הרגשה של הסביבה.

נחזור לפלוריפוטנטיות- cdx2 עושה ריפרסייה ל- oct4 ול-nanog. ללא cdx2 תאים שאמורים לעשות ריפרסייה ל nanog ו- oct4 הם מעלים את oct4. מסקנה cdx2 עושה ריפרסייה ל- oct4 ול-nanog. כדי לעשות promotion לטרופואקטודרם cdx2 צריך לדכא oct4  ו- nanog שהם גנים מאפשרים פלוריפוטנטיות. אם נדכא אותם נאפשר לתאים להפוך לטרופואקטודם, לאבד מהפלוריפוטנטיות שלהם. בשלב של שמונת התאים כולם מבטאים cdx2 ולכן אם רוצים ליצור ICM חייב לדאוג שאין cdx2 כי אם יהיה לי אין שום סיכוי ליצור ICM.  

מה הקשר בין מישור החלוקה ל- cdx2? אם יש רמות גבוהות של cdx2 החלוקה תהיה סימטרית! ואם יהיו לי רמות נמוכות אז החלוקה תהיה אסימטרית. כלומר ל- cdx2  יש השפעה גם על הפולריות וגם על מישור החלוקה.